基于随机突变体构建的克罗诺杆菌逆境相关基因的发掘研究

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1、单位代码：10359密级：公开学号：2015111126分类号：Q93HefeiUniversityofTechnology硕士学位论文MASTER’SDISSERTATION（学术硕士）论文题目：基于随机突变体构建的克罗诺杆菌逆境相关基因的发掘研究学科专业：微生物学作者姓名：张茂峰导师姓名：叶应旺教授完成时间：2018年3月合肥工业大学学历硕士学位论文基于随机突变体构建的克罗诺杆菌逆境相关基因的发掘研究作者姓名：张茂峰指导教师：叶应旺教授学科专业：微生物学研究方向：微生物的生长代谢及调控2018年3月ADissertat

2、ionSubmittedfortheDegreeofMasterInvestigationonGenesInvolvedinTolerancetoDifferentStressesinCronobactermalonaticusbyRandomMutagenesisByZhangMaofengHefeiUniversityofTechnologyHefei,Anhui,P.R.ChinaMarch,2018致谢岁月如梭，如歌。转眼间，三年的研究生求学生活即将结束，站在毕业的门槛上，回首往昔，奋斗和辛劳成为丝丝的记忆，甜美与

3、欢笑也都尘埃落定。合肥工业大学以其优良的学习风气、严谨的科研氛围教我求学，以其博大包容的情怀胸襟、浪漫充实的校园生活育我成人。值此毕业之际，我谨向所有关心、爱护、帮助我的人们表示最诚挚的感谢与最美好的祝愿。本论文是在导师叶应旺教授的悉心指导之下完成的。三年来，导师渊博的专业知识，严谨的治学态度，精益求精的工作作风，诲人不倦的高尚师德，朴实无华、平易近人的人格魅力对我影响深远。导师不仅授我以文，而且教我做人，虽历时三载，却赋予我终生受益无穷之道。本论文从选题到完成，几易其稿，每一步都是在导师的指导下完成的，倾注了导师大量的心

4、血，在此我向我的导师叶应旺教授表示深切的谢意与祝福！本论文的完成也离不开其他各位同学和朋友的关心与帮助。感谢同门的师兄师妹们，在科研过程中给我以许多鼓励和帮助。回想整个论文的写作过程，虽有不易，却让我除却浮躁，经历了思考和启示，也更加深切地体会了法学的精髓和意义，因此倍感珍惜。还要感谢父母在我求学生涯中给与我无微不至的关怀和照顾，一如既往地支持我、鼓励我。求学生涯暂告段落，但求知的道路却永无停滞。三年的工大生活给予我许多珍贵的财富，教会我许多难能的品质。精勤求学，敦笃励志，果毅力行，忠恕任事——这十六字箴言将伴随我在以后的

5、人生道路上，勇敢地不断前行。作者：张茂峰2018年2月I摘要克罗诺杆菌是一种兼性厌氧革兰氏阴性菌，通常以婴幼儿配方奶粉为主要感染渠道，对婴幼儿的身体健康造成严重危害。该菌可引起新生儿细菌性脑膜炎、坏死性小肠结肠炎和菌血症等，且致死率高达40%-80%。克罗诺杆菌分布广泛且严重危害某些特定人群（如新生儿）生命而被广泛关注。克罗诺杆菌的抗逆性很强，而目前对克罗诺杆菌抗逆性的相关基因研究鲜有报道。本课题以丙二酸盐克罗诺杆菌野生株为主要研究对象，通过质粒结合转移的方法构建克罗诺杆菌的突变体库。基于突变株和野生株在不同逆境胁迫下（渗

6、透压胁迫、氧化应激胁迫、干燥胁迫、酸胁迫）生长情况，筛选出具有代表性的不同逆境耐受突变株；通过随机PCR反应及数据库比对确定其突变位点。在此基础上，开展结晶紫染色测量突变株和野生株生物膜形成能力实验研究，并借助激光共聚焦和扫描电子显微镜表征逆境胁迫下野生株和突变株的生物膜微观变化。结果表明，1.渗透压胁迫相关因子包括：内膜蛋白YhjD、钾离子外流蛋白KefA、肽基辅氨酰异构酶、半胱氨酸-tRNA复合结构脱酰基酶、寡聚半乳酸裂解酶；2.干燥胁迫相关因子包括：葡萄糖-6-磷酸异构酶、糖基水解酶、海藻糖-6-磷酸合酶、外膜蛋白A

7、、碳磷裂解酶复合物亚基团；3.氧化应激胁迫相关因子包括：泛酰酸激酶、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、丙酮酸激酶、磷脂酶A、丙氨酸消旋酶2、铁离子转运蛋白A、硫氧还蛋白2和谷氧还蛋白3；4.酸胁迫相关基因包括：葡萄糖基转移酶MdoH、胞外丝氨酸蛋白酶、硫酸盐转运体、磷酸盐转运体亚基,并且我们发现除了糖基水解酶之外，其他突变株生物膜形成较野生株均为显著下降，可见，克罗诺杆菌通过产生生物膜增强自身在逆境条件下的存活能力，研究结果为探究克罗诺杆菌抗逆性机制提供了基础理论数据，对预防和控制食品加工过程中的克罗诺杆菌的污染具有重要意义。关键词

8、：克罗诺杆菌；基因突变；逆境胁迫；生物膜IIABSTRACTCronobacterisagroupoffoodbornepathogens,whichcancauseneonatalmeningitis,baeteremia,andnecrotizingentemcohtisthroughthepowd