氧化应激对人类精子自噬影响的研究

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1、分类号：R698学号：201500370009硕士学位论文氧化应激对人类精子自噬影响的研究EffectsofOxidativeStressonAutophagyinHumanSpermatozoa研究生姓名：李惠指导教师：李建远教授专业学位类型：生物学专业学位领域：理学论文提交日期：2018年4月1日摘要众所周知，活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)是一种氧代谢副产物，普遍存在于所有细胞中，与抗氧化剂相互平衡。当细胞中活性氧含量过量或抗氧化剂耗竭又或者两者兼而有之时，会导致这种微妙的平衡受到干扰，发生氧化应激。在

2、活性氧处于中等水平时，活性氧可以发挥一些积极作用，参与相关的信号传导途径，例如针对病原体的防御或精子中的受精准备。然而，过高水平的活性氧以其破坏作用被大众所知，影响所有生物分子并最终导致细胞应激甚至死亡。线粒体是哺乳动物细胞中ROS的主要产生者和靶标。人类精子内活性氧水平氧化应激导致精液参数异常，与男性不育症密切相关，已成为男性不育的重要因素。自噬对应激反应做出应答及清除氧化受损细胞器起重要作用。本研究以人类精子为实验材料，建立精子氧化应激方法，利用免疫荧光结合激光共聚焦荧光显微镜观察外源性过氧化氢和超低温保存这两种形式的氧化应激对人类

3、精子内自噬的影响。首先采用非连续密度梯度法优选人类精子，降低精液中杂质对实验结果的影响；利用计算机辅助精子分析精液常规参数；不同浓度的外源性过氧化氢处理精子(0mMH2O2、0.5mMH2O2、1mMH2O2)，建立氧化应激方法；程序性液氮超低温保存精子标本，建立氧化应激方法；利用DCFH-DA探针染色的方法检测人类精子内活性氧水平；利用MitoTracker®RedCMXRos探针染色的方法检测人类精子线粒体膜电位变化情况；利用WesternBlot验证人类精子内自噬起始蛋白的表达；利用免疫荧光结合激光共聚焦荧光显微镜观察人类精子内自

4、噬相关蛋白的表达定位；利用免疫荧光共定位结合激光共聚焦荧光显微镜观察人类精子线粒体自噬蛋白的表达定位。取得的主要结果如下：(1)新鲜精液液化后，采用非连续密度梯度离心法优选后的人类精子。经计算机辅助精子分析，洗涤后与洗涤前相比，PR%显著升高，PR+NP%也显著升高。(2)经计算机辅助精子分析，过氧化氢组(0.5mMH2O2、1mMH2O2)与对照组(H2O)相比PR%显著降低，PR+NP%也显著降低。分析精子内活性氧水平发现，过氧化氢组(0.5mMH2O2、1mMH2O2)与对照组(H2O)相比精子内活性氧水平显著升高。对精子线粒体膜

5、电位分析发现，过氧化氢组(0.5mMH2O2、1mMH2O2)II与对照组(H2O)相比精子线粒体膜电位显著降低。WesternBlot验证人类精子内自噬起始蛋白，结果显示，过氧化氢组(0.5mMH2O2)与对照组(H2O)相比精子内LC3-II/LC3-I比值显著升高。免疫荧光结合激光共聚焦荧光显微镜分析，自噬蛋白LC3表达主要位于精子头部及尾部中段，过氧化氢组(0.5mMH2O2、1mMH2O2)与对照组(H2O)相比LC3表达量显著升高；自噬蛋白p62表达主要位于精子头部及尾部中段，过氧化氢组(0.5mMH2O2、1mMH2O2)

6、与对照组(H2O)相比p62表达量显著升高。免疫荧光结合激光共聚焦荧光显微镜分析发现，外源性过氧化氢处理后，自噬蛋白LC3与精子线粒体共定位，表明线粒体发生自噬。(3)经计算机辅助精子分析，融解后与冷冻前相比PR%显著降低、PR+NP%也显著降低。分析精子内活性氧水平发现，融解后与冷冻前相比精子内活性氧水平极显著升高。对精子线粒体膜电位分析发现，融解后与冷冻前相比精子线粒体膜电位显著降低。免疫荧光结合激光共聚焦荧光显微镜分析发现，自噬蛋白LC3表达主要位于精子头部及尾部，融解后与冷冻前相比LC3表达量极显著升高；自噬蛋白p62表达主要位

7、于精子头部及尾部中段，融解后与冷冻前相比p62表达量极显著升高。综上所述，氧化应激(外源性过氧化氢和超低温保存)对人类精子造成氧化损伤，使人类精子内活性氧水平升高，线粒体膜电位下降，导致精子运动能力下降；过量活性氧导致的氧化应激激活精子自噬，但自噬过程受阻，自噬溶酶体降解效率低。关键词：人类精子；氧化应激；自噬IIIAbstractItiswell-knownthatreactiveoxygenspecies(ROS)isabyproductofoxygenmetabolismthatisubiquitousinallcellsandb

8、alanceswithantioxidants.Whentheamountofactiveoxygeninthecellisexcessiveortheantioxidantdepletesorboth,t