自噬的调控对大鼠矽肺纤维化影响的研究

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1、中图分类号：R135.2论文编号：HBLG2015-038UDC：密级：公开硕士学位论文自噬的调控对大鼠矽肺纤维化影响的研究作者姓名：时亚欣学科名称：公共卫生与预防医学研究方向：劳动卫生与环境卫生学学习单位：华北理工大学学习时间:3年提交日期:2015年4月21日申请学位类别：医学硕士导师姓名：金玉兰副教授单位：华北理工大学姚三巧教授单位：河南新乡医学院论文评阅人：匿名单位：匿名单位：论文答辩日期：2015年6月8日答辩委员会主席：赵金垣教授关键词：肺巨噬细胞；自噬；肺纤维化；3-甲基腺嘌呤；雷帕霉素唐山华北理工大学2

2、015年6月ResearchtheEffectsoftheRegulationofAutophagytoSilicosisFibrosisofRatsDissertationSubmittedtoNorthChinaUniversityofScienceandTechnologyinpartialfulfillmentoftherequirementforthedegreeofMasterofMedicinebyShiYaxin(PublicHealthandPreventiveMedicine)ProfessorJi

3、nYulanSupervisor:Ph.DYaoSanqiaoJune,2015独创性说明本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得华北理工大学以外其他教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。论文作者签名：日期：年月日关于论文使用授权的说明本人完全了解华北理工大学有关保留、使用学位论文的规定，即：已获学位的

4、研究生必须按学校规定提交学位论文，学校有权保留、送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以将学位论文的全部或部分内容采用影印、缩印或编入有关数据库进行公开、检索和交流。作者及导师同意论文公开及网上交流的时间：□自授予学位之日起；□自年月日起。作者签名：导师签名：签字日期：年月日签字日期：年月日摘要摘要目的1本研究通过3-甲基腺嘌呤抑制自噬和雷帕霉素诱导自噬活动，观察染尘不同时间大鼠肺组织HE染色和Masson染色，同时对肺组织中胶原纤维面积的测定和血清中细胞因子含量的测定，分析各阶段矽肺纤维化发生发展过程。2通过

5、电镜切片和肺组织内蛋白水平的表达，观察肺巨噬细胞（Alveolarmacrophage,AM）自噬活动的强弱，分析细胞自噬与矽肺纤维化的关系。3纯化细胞灌洗液中的肺巨噬细胞，测其早期凋亡率，分析细胞自噬与细胞凋亡两者的联系。方法120只SPF级健康雄性Wistar大鼠随机分为三组：模型组、三甲基腺嘌呤组（3-methlyadenine，3-MA）组和雷帕霉素组，每组均为40只。各组大鼠按照支气管灌注的方式进行矽肺常规造模。每组大鼠均在染尘第7天、14天、28天、60天和90天分别处死8只，收集左侧肺组织灌洗液，提取肺巨

6、噬细胞，运用流式细胞仪检测肺巨噬细胞早期凋亡率；心脏取血，离心获取血清，使用酶联免疫法测定血清中细胞因子TNF-ɑ、TGF-β和IL-10的含量，观察肺纤维化的发展进程；取100mg左右的左侧肺组织，实时定量荧光聚合酶链式反应（Real-timePCR）分析Ⅰ型和Ⅲ型前胶原mRNA表达水平；取适量肺组织匀浆、组织裂解液裂解后，运用免疫印迹法测定肺组织内LC3、Beclin1、AKT和PDK1的蛋白表达水平；取120mg左右的肺组织，按照试剂盒说明测定其羟脯氨酸含量；将黄豆粒大小的右侧肺组织放入多聚甲醛溶液，行肺组织的H

7、E染色和Masson染色，观察各实验组大鼠肺组织的病理变化情况和组织内胶原纤维的变化情况，并运用IPP（ImageProPlus）图像分析软件测定胶原纤维的面积；取粟粒大小肺组织经2.5％的戊二醛溶液固定,制作电镜切片，观察肺巨噬细胞自噬活动的强弱程度。结果1各实验组大鼠肺组织HE染色：模型组大鼠肺组织内有炎性细胞浸润，肺泡壁明显增厚，肺泡腔减小，肺组织中成纤维细胞增多，随着染尘时间肺组织内出现大量的细胞结节和典型的矽结节；3-MA组大鼠在染尘早期肺组织的炎症反应不明显，但肺组织内仍有少量的炎性细胞浸润，在染尘后期大鼠

8、肺组织内有细胞结节但没有明显的矽结节；雷帕霉素组大鼠在染尘初期的炎性反应程度比模型组严重，染尘中期出现大量的成纤维细胞，并且有典型的矽结节，染尘后期肺组织纤维化程度严重，肺组织被完全破坏。2各实验组大鼠肺组织Masson染色：Masson染色观察肺组织中胶原纤维的变化情况，运用形态学定量分析系统对胶原面积测定，发现模型组大鼠胶原纤