水牛卵泡颗粒细胞自噬及其调控对细胞增殖的影响研究

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1、巧女学化伦义水牛卵泡颗粒细胞自旌及其调控对细胞增殖的影响研究１．．．李并爲爲乂學二〇—五年六月Ａ类号Ｓ８１４．８密级公开ＵＤＣ硕±学位论文水牛卵泡颗粒细胞自瞻及其调控对细胞增殖的影响研究李巧学科专业动物溃传育种与繁满指导教师石德顺研究员李湘萍研究员．５．２６学位授予日期论文答辩日期２０１５答辩委员会主席卢克焕教授广西大学学位论文原创性和使用授权声明本人声明所呈交的论文，是本人在导师的指导下独立进行研巧所取得的研究成果。除已特别加Ｗ标注和致谢的地方外，论文不包含任何其他个

2、人或集体已经发表或撰写的研究成果，也不包含本人或他人为获得广西大学或其它单位的学位而使用过的材料一同工作的。与我同事对本论文的研究工作所做的贡献均已在论文中作了明确说明。本人在导师指导下所完成的学位论文及相关的职务作品，知识产权归属广西大学。本人授权广西大学拥有学位论文的部分使用权，良Ｐ：学校有权保存并向国家有关部口或机构送交学位论文的复印件和电子版，允许论文被査阅和借阅，可将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可Ｗ采用影印、缩印或其它复制手段保存。、汇编学位论文本学位论文属于：□保密，在年解密后适用授权。囚不保密。＂＂

3、请在上相应方框内打Ｖ（）论文作者签名；巧曰期：戶／玉＾／。目争勺指导教师签名曰期＾／戸、Ｗ作者联系电话：电子邮箱：水牛卵泡颗粒细胞自隘及其调控对细胞增殖的影响研究摘要一个极为复杂且受到精密调控的生理过程哺乳动物卵泡发育是。颗粒一细胞作为卵泡的种主要体细胞，在卵泡发育和卵母细胞成熟过程中起到重要作用，其功能状态决定卵泡的命运。细胞自幢是ＩＩ类程序性细胞死ｔ：，由自唆引起的细胞死亡一定程度上能，可双重调节细胞的死亡和存活，在扭转细胞调亡的命运，成为细胞存活的促进性因素。目前有关大鼠等动物卵巢颗粒细胞自隨已有许多研巧进展，但对水牛颗粒细胞自瞻及其

4、与洞亡。的关系研究较少本研究首先按照不同划分标准对卵泡进行分类，包括卵泡直径大小和卵泡闭锁程度，探究卵泡发育阶段与颗粒细胞自唆和调亡的。关系，分析卵泡颗粒细胞自瞻、调亡相关基因的表达规律然后，利用雷帕霉素作为ｍＴＯ民途径的抑制剂调控自瞻，研究其对体外培养水牛颗粒细胞自隧、调ｔ、生长曲线、细胞周期及相关基因表达的影响，初步探索雷一帕霉素调控自隨对细胞生长增殖的作用，为进步优化水牛颗粒细胞体外培养条件奠定基础。－１、不同发育阶段水牛卵泡颗粒细胞自唆及潤亡的分析；采用ＧＦＰＬＣ３Ａｎｎｅｘ－转染、ｉｎＶＦＩＴＣ／ＰＩ双染检测不同大小和不同闭锁程度水牛卵泡颗

5、粒。细胞的自隨和调亡状态结果显示，两种卵泡分类方法试验中，与小卵泡和中卵泡颗粒细胞相比，大卵泡颗粒细胞的自瞻率和非活细胞率最高，调亡率最低与健康和早期闭锁卵泡颗粒细胞相比，晚期闭锁卵泡颗粒细胞；－的自趟率和调亡率较高。运用ｑＲＴＰＣ民方法分析不同大小和不同闭锁程度－水牛卵泡颗粒细胞中Ａｔｇ３、ＬＣ３、ＢＥＣＮ１等自隆相关基因和Ｂｃｌ２、Ｂａｘ、Ｐ５３等调亡相关基因的表达，结果显示，各基因在不同大小卵泡和不同闭锁。、程度卵泡颗粒细胞中均有表达与小和中巧泡中的颗粒细胞相比，Ａｔｇ３Ａｔｇ５、Ａｔｇ７、Ａｔｇｌ２、ＢＥＣＮ１、ＬＣ３自喧相关基因在大卵泡颗粒细胞中

6、的表达显著增加（户＜０．０５），ＵＬＫ１基因表达则最低，差异显著（户＜０．０５）。Ａｔｇ３、Ａｔｇ５、Ａｔｇｌ２、ＢＥＣＮ１和ＬＣ３基因在晚期闭锁卵泡颗粒细胞中的表达最高，＜（戶０．０５）Ａｔ７和ＵＬＫ１基因在健康卵泡颗随着卵泡闭锁呈现出显著升高；ｇ粒细胞中表达量最高，随着卵泡巧锁程度的增加，二者的表达量逐渐降低。ＬＣ３蛋白在成熟卵泡中的表达比原始卵泡中多，与卵泡发育程度呈正相关。２、调控自唆对体外培养水牛颗粒细胞增殖的影响：首先采用透射电镜对体外培养的水牛颗粒细胞进行形态学观察，发现正常培养条件下多种状态的细胞并存，发生自隨的细胞中可观察到自嗟体和自随

7、溶酶体。其次，添加雷帕霉素处理体外培养的水牛颗粒细胞，与添加１０％血清ＤＭＥＭ培养的颗粒细胞相比，发现细胞自幢率和澗亡率均显著升高（戶＜０．０５）。流式细胞仪分析细胞周期结果显示，雷帕霉素处理后，Ｇ０／Ｇ１期细胞比例增加，ＳＧ２ＭＲＴ－期和／期细胞比例减少。运用ＰＣ民方法分析雷帕霉素处理后Ａｔ３、ｑｇ５ＵＬＫＢｃｌ－５３Ａｔｇ、１等自瞻相关基因及２、Ｂａｘ、Ｐ等调亡相关基因的表达，０．２ｎＭ处理条件下，与添加