缺氧对肠上皮细胞自噬的影响

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1、缺氧对肠上皮细胞自噬的影响近年来，自噬在组织缺血缺氧性损害中的作用已受到广泛关注，下面是小编搜集整理的一篇探究缺氧对肠上皮细胞自噬影响的论文范文，供大家阅读参考。　　自噬(autophagy)是由Ashford和Porter[1]在1962年发现细胞内存在自己吃自己的现象后提出，系指由细胞粗面内质X或高尔基体等脱落的双层膜包裹部分细胞质和受损的细胞器及蛋白质，而后与溶酶体融合降解其所包裹内容物，从而实现细胞本身的代谢需要和细胞器的更新[2].据研究[3-5],自噬在细胞生长发育中起重要作用，且在各种应激及疾病如缺血缺氧性损害、肿瘤、神经退化等病理过程中也扮演着至关重要的角色。严重烧伤

2、或创伤后易发生失血性休克，导致全身组织缺血缺氧，为保证心脑血管等重要脏器血流供应，机体常出现代偿反应，即血液重分布，在血液重分布情况下肠道又是最常受累的器官，由肠道组织灌流不足、氧需求增加及高代谢所造成的缺氧，导致肠黏膜结构与功能受损。缺血缺氧所致胃肠道上皮细胞的自噬情况目前研究甚少，本研究利用体外缺氧模型模拟胃肠道缺血缺氧，动态观察Caco-2肠上皮细胞在缺氧条件下的自噬变化情况，旨在了解缺氧对肠上皮细胞自噬的影响，为研究自噬在缺氧后肠上皮损害中的作用奠定基础。　　一、材料与方法　　1实验材料　　Caco-2肠上皮细胞株由中国科学院上海细胞研究所提供，P62抗体、Beclin1抗体

3、、β-肌动蛋白(β-actin)抗体购自美国SIGMA公司，微管相关蛋白1轻链3(LC3)抗体购自美国CST公司，辣根过氧化物酶(HRP)标记二抗为美国SouthernBiotech公司产品，绿色荧光蛋白(GFP)-LC3B由第三军医大学生物医药中试研究基地唐彬博士赠送，改良伊格尔培养基(DMEM)及还原血清培养基(OPTI-MEM)均购自美国Gibco公司，胰蛋白酶购自BBI公司，常氧培养箱和缺氧培养箱均购自美国ThermoScientific公司，超敏化学发光检测试剂盒为Advansta公司产品，聚偏二氟乙烯(PVDF)膜为Millipore公司产品，蛋白印迹

4、相关试剂﹑蛋白测定试剂盒﹑电转仪﹑电泳仪及ChemiDocXRS型凝胶图像分析系统均购自美国Bio-Rad公司，UD-201型组织细胞超声破碎仪购自日本TOMY公司，冷冻离心机AllegraTMX-22R购自美国Beckman公司，TCSSPS型激光共聚焦显微镜为德国Leica公司产品，H-600型透射电镜为日本日立公司产品。　　2细胞培养与处理　　Caco-2细胞用含体积分数为10%胎牛血清(FBS)、100μg/mL链霉素、100U/mL青霉素、2mmol/L谷氨酰胺、1mmol/L非必需氨基酸、pH7.4的DMEM培养基培养，当细胞长至约90%融合时，用25g/L胰蛋白酶

5、及0.53mmol/L乙二胺四乙酸液消化，按1∶3比例传代培养。将细胞接种于6孔板，隔天更换培养液，直到细胞完全融合。将细胞接种于含盖玻片(鼠尾胶原包被)的24孔板，到细胞贴壁后处理。　　细胞缺氧处理按照文献方法[6]进行，将细胞完全融合的6孔板放入缺氧培养箱中，充入由体积分数为1%O2、5%CO2和94%N2组成的混合气体(重庆朝阳气体厂)，放置于37°C细胞培养箱中培养。根据缺氧时间不同将细胞分为常氧组(缺氧0h)，缺氧(0.5、1、2、6、12、24h)组。将鼠尾胶原包被盖玻片的24孔板分为常氧组(正常培养箱中培养6h)和缺氧6h组。　　3检测指标与方法　　3.1肠上皮

6、细胞Beclin1、P62和LC3蛋白表达的检测采用蛋白质免疫印迹法[7]检测，以β-actin作内参，方法简述如下：用4℃磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗细胞后即加入细胞裂解液放置冰上低温裂解细胞，收集样本于1.5mL尖底离心并用细胞超声破碎仪破碎，离心(12000r/min、10min、4℃)，取上清液煮沸5min,行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳并转移至PVDF膜。用5%脱脂奶粉室温封闭1h,然后分别加入兔抗Beclin1抗体、兔抗P62抗体、兔抗LC3抗体及鼠抗β-actin抗体，4℃孵育过夜。次日以吐温-20-三羟甲基氨基甲烷盐缓冲液(

7、TBST)洗膜4次后分别加入二抗HRP-羊抗兔IgG和HRP-羊抗鼠IgG,室温孵育1h.再次用TBST洗膜4次后加入化学发光液，用凝胶图像分析系统采集发光信号。QuantityOne软件对蛋白表达行相对定量分析，Beclin1及P62蛋白表达量分别以Bec-lin1或P62与LC3Ⅰ蛋白的比值表示，LC3蛋白表达量以LC3Ⅱ与LC3Ⅰ的比值表示。　　3.2透射电镜检测自噬用细胞刮常规收集6孔板贴壁细胞，置于尖底离心管离心(1000r/min、8min),