LncRNA MEG3胞内结合蛋白的亲和纯化与下游靶基因的筛选

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1、密级硕士学位论文＃ＬｎｃＲＮＡＭＥＧ３胞内结合蛋白的亲和纯化与下游靶基因的筛选雪！：祥作者姓名：指导教师：雷海新学科专业：生物化学与分子生物学大连医科大学大连医科大学硕士毕业论文目录一、摘要……………………………………………………………1（一）中文摘要……………………………………………………1（二）英文摘要……………………………………………………3二、正文……………………………………………………………6（一）前言…………………………………………………………6（二）材料和方法………………………………………………

2、…81.材料...................................................................................82.方法..................................................................................15（三）结果………………………………………………………...25（四）讨论………………………………………………………...39（五）结论………………………………………………………...40（六）参考文献…

3、………………………………………………...41三、综述………………………………………………………….44（一）综述……………………………………………………….44（二）参考文献…………………………………………………...49四、致谢………………………………………………………….52大连医科大学硕士毕业论文LncRNAMEG3胞内结合蛋白的亲和纯化与下游靶基因的筛选摘要背景：乳腺癌是导致女性死亡的主要恶性肿瘤，原因在于缺乏专一而有效的治疗靶点，因而寻找特异的治疗靶点是乳腺癌研究中的一大难题。lncRNAs是一组不编码蛋白质的转录体，长度大于200个核苷酸

4、，lncRNA在细胞周期和分化调控等众多生命活动中发挥重要作用，如调控细胞结构的完整性，控制的亚细胞定位，和表观遗传修饰等。长链非编码RNA功能的发挥通常依赖于互作蛋白，如lncRNATERRA就是通过与hnRNPA1互作，实现细胞的永生化。lncRNAMEG3（MaternallyExpressedGene3）是一种母系遗传的印记基因，位于人类染色体14q32，在人体多种正常组织中表达，在脑和垂体高表达，而在非小细胞肺癌和乳腺癌等肿瘤细胞中不表达或低表达，在癌细胞系如HeLa，H4和CH157-MN中重新表达MEG3，均可抑制细胞增殖。此外MEG3能

5、够促进肿瘤抑制基因p53蛋白表达水平，增强p53与其靶基因启动子的结合。MEG3可通过刺激p53依赖的转录在体外和体内诱导细胞凋亡。近年来在肺癌细胞中有研究者运用ChIRP技术检测到MEG3可以招募PRC2复合体的组件JARID2及其靶基因，形成DNA-RNA的复合体，实现H3K27的甲基化，进而影响EMT进程。在本文中我们建立并优化了在乳腺癌中lncRNAMEG3胞内结合蛋白的亲和纯化技术，结合质谱(MS-LC)技术，筛选出lncRNAMEG3的相互作用蛋白。并且在乳腺癌细胞中通过RNA-seq技术鉴定过表达与敲低MEG3之后下游靶基因的变化，聚类分

6、析后筛选出与表型相关的靶基因，通过检测MEG3的结合蛋白以及其下游靶基因，对于进一步明确MEG3在乳腺癌中发挥抑制细胞增殖，迁移以及克隆形成的作用机制有着重要的意义，并为lncRNA在癌症发生发展中的机制研究提供借鉴。方法：1.利用RT-PCR的方式，检测MEG3在人胚肺成纤维细胞MRC5与不1大连医科大学硕士毕业论文同乳腺癌细胞系(T47D，HCC1954，MDA-MB-231，MCF7)中的表达情况。2.利用Lenti-XTet-On3G诱导表达系统，构建Plvx-TRE3G-MEG3以及Plvx-TET3G两个质粒，共转染MDA-MB-231以及

7、MCF7乳腺癌细胞嘌呤霉素药筛实现MEG3稳定过表达。3.本文通过CRISPRi技术，设计了靶定MEG3启动子区的sgRNA，sgRNA的质粒上还带有KRAB区域，当dCSA9结合靶定区后，KRAB发挥转录抑制的作用，从而在转录水平上实现MEG3在正常乳腺上皮细胞的稳定敲低。4.利用MTT检测稳定过表达以及敲低MEG3对细胞增殖的影响；利用划痕实验检测稳定过表达以及敲低MEG3对细胞迁移的影响；利用克隆形成实验检测稳定过表达以及敲低MEG3对细胞克隆形成等生物学功能的影响5.利用RNAseq检测MEG3过表达或者敲低后下游靶基因的变化。6.利用优化后的

8、lncRNP亲和纯化技术，筛选出MEG3结合蛋白：SDS-PAGE胶银染后得到相较于反向以及空