丁香假单胞大豆致病变种hrpz基因的克隆及编码蛋白的纯化与功能研究

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CLO八ⅡNGANDFUNCTIONANALYSIS0FhrpZFROMPseudomonassyringaepv．glycineaByYanZhangADISSERTATIoNSubmittedtoNanjingAgriculturalUniversity,Nanjing，ER．ChinaInPartialFulfillmenttheRequirementsfortheMasterDegreeofAgronomyDirectedbyProfessorXuewenGaoNanjingAgficulturalUniversityNanjing210095，P．R．ChinaJune，2012 原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中己经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者(需亲笔)签名：；杉募≯J1年6月步日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权南京农业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编学位论文。，保密口，在——年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密耐。(请在以上方框内打“√”)学位论文作者(需亲笔)签名：；岳先导师(需亲笔)签名：南可&加J1年1月矿日‰l癖‘月哥日 目录摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．IABSTRACT⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯Ⅲ上篇文献综述第一章植物的防卫反应和系统获得抗性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。ll植物．病原物的互作⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．t1．1病原物致病基因⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11．2植物的先天免疫反应⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯21．3植物的防卫基因类型⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯32植物系统获得抗性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯52．1水杨酸(SA)介导的SAR⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯62．2植物的过敏反应与系统抗病性的关联⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯，9第二章植物病原细菌中的harpin类蛋白研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．11l已报道的harpin类蛋白及其生物学效应⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．1l1．1harpin蛋白的生物学效应⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯ll1．2植物病原细菌中的harpm类蛋白⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．122hm'pin蛋白的分子结构特点⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．132．1hm'pin蛋白在植物上的作用位点⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯132．211arpin蛋白的关键功能域研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯l53h'pin蛋白诱导植物防卫反应的分子机理⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。163．1harpin蛋白激发HR的信号通路⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯163．2harpin蛋白激发的HCD信号通路与抗病之间关系⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．184harpin蛋白在实际生产中的应用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。194．1harpin蛋白在基因工程中的应用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯194．211arpin蛋白在微生物农药研发中的应用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．20下篇研究内容第一章丁香假单胞大豆致病变种harpin编码基因的克隆与表达⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯231材料和方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一241．1菌株和质粒⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一24l-2主要试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。25 1．3培养基、抗生素和培养条件⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．251．4缓冲液⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯261．5大豆细菌性斑点病菌基因组DNA的提取⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯271．6引物的设计与合成⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．281．7hrpZ基因的扩增⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．291．8PCR产物的纯化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯291．9PCR产物与pMDl8．T载体连接⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯301．10大肠杆菌感受态的制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。301．1l连接产物的转化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯301．12质粒的提取⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。311-13质粒酶切及PCR验证⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．311．14hrpZ的生物信息学分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。321．15harpin融合表达载体的构建⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯321．16harpin融合蛋白表达的影响因素⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯321．17SDS．PAGE凝胶电泳检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯332结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯342．1丁香假单胞大豆致病变种h,7,z基因的克隆⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．342．2hrpZ的生物信息学分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．352．3harpin蛋白的表达及影响因素⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯373讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．38第二章ha_r'pirlZpsg$1蛋白的纯化及生物活性检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4l1材料和方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．421．1菌株⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．421．2主要试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯42培养基、抗生素和培养条件⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。421．4缓冲液⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯421．5harpinZpsgsl蛋白的纯化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．431．6树脂的再生与储存⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。“1．7harpi．nZpsgsl蛋白的脱盐和浓缩⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．441．8纯化harpinZl,。gSl蛋白的浓度测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．441．9harpinZpsgsi蛋白的鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．452结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．452．1har'pinZpsgsl蛋白的纯化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。45 2．2纯化harpinZPsgsl蛋白的浓度⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．462．3harpinZ吨st蛋白的鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．473讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一48第三章harpinZPsgsi蛋白诱导烟草系统获得抗性机理研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．491材料和方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．501．1菌株、培养条件和供试植物⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．501．2培养基⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。501．3harpinZh#t蛋白的表达⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一511．4t脚pinzPsgSl蛋白的纯化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。511．5harpinZt,sgsl蛋白的浓度测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．511．6烟草叶片RNA的提取⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5l1．7RNA的定性与质量检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．521．8mRNA反转录cDNA⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。521．9Real-timePCR⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．．．．⋯⋯⋯⋯⋯．．．．．．．．⋯．⋯⋯⋯．．．．．⋯⋯⋯⋯．．．．．531．10烟草生长量的测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一551．1l烟草对TMV抗性的测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯551．12烟草对烟草疫霉抗性的测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．562结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．562．1harpiI亿Psgsl促进烟草的生长⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．56harpinZp,#诱导烟草对TMV的抗性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯572．3harpiI亿Psgsl诱导烟草对烟草疫霉的抗性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯582．4harpinZP|#t激发植物防卫反应相关基因的表达⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯593讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。63全文总结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯65参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯67附录⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一75致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。77攻读硕士期间发表的学术论文⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．79 摘要丁香假单胞大豆致病变种hrpZ基因的克隆及编码蛋白的纯化与功能研究大豆细菌性斑点病是我国尤其是北方大豆产区的一种重要病害，给农业生产带来巨大损失，其病原物为丁香假单胞大豆致病变种(Pseudomonassyringaepv．glycinea)是世界范围内重要的植物病原细菌。同其他革兰氏阴性植物病原细茵一样，大豆细菌性斑点病菌可以在非寄主植物和抗病植物上激发过敏反应(hypersensitiveresponse，FIR)，在感病寄主上具有致病性(pathogenicity)，这一特性由细菌中却基因簇决定．hrp基因簇的特定基因编码产物harpin是一类可以在非寄主植物上激发HR的非特异性蛋白激发子，是目前研究得较为深入的一类细茵分泌蛋白．目前，对于大豆细茵性斑点病菌harpin蛋白编码基因hrpZ的功能研究甚少，国外只在Race4和Psgr0菌株中克隆和表达harpin蛋白。国内研究人员克隆并表达来自Psgl2菌株中的harpin蛋白，与国外报道的矗啦基因同源性为79％。由此，我们推断来自丁香假单胞大豆致病变种hat'pin编码基因可能存在多样性，其编码的harpin蛋白的活性和功能也可能存在差异。本实验室前期从北方大豆产区分离和鉴定了7株大豆细菌牲斑点病菌，并对病原茵的Ⅲ型效应分子进行了研究。在此基础上，本文从A1和Sl菌株中克隆了I卿缸编码基因，命名为hrpZ?酬和hrpZe，gsl，通过生物信息学分析，确定harpinZpssAi和hax'pinZps8sl属于harpin家族第三组群，假单胞组群。并且，可将来自丁香假单胞大豆致病变种hrpZ基因分为两类，这两类hrpZ基因的核苷酸同源性为79％，氨基酸同源性为77％，均富含甘氨酸，不舍半胱氨酸，富含保守的LIHEKLGDNFGASA功能序列，与假单胞茵属以外的其他革兰氏阴性植物病原细菌不存在相似性。本研究丰富了世界范围内来源于户syringae的hrpZ基因资源，补充了我国来源于丁香假单胞大豆致病变种的hrpZ基因资源。为了了解来自A1扣S1菌株harpin蛋白的生物活性和生物学功能，本研究利用GST基因操作系统获得了JjI咖，和hrpZesgsl的基因产物，分别命名harpinZpsgAi和harpillzPsgsl，对harpinZesgsl进行了纯化，每升BL21／pET41a(+)．hrpZe,gs，发酵液经High-AffinityGSTResin纯化，可提纯harpLnZ．psgs!蛋白约20rag。纯化的harpin蛋白为进一步研究其结构和功能提供了更为有利的基础。生物活性测定结果显示，ha／'pillZp。gsl对热稳定，对蛋白K敏感，可以在非寄主植物烟草上激发过敏反应，并且过敏反应可以被真核生物代谢抑制剂所抑制，具备harpin 丁香假单胞大豆致病变种砌，z基因的克隆及编码蛋白的纯化与功能的研究蛋白的生物学特征。harpinZp赡sl激发HR的最小浓度为100lag／ml，低浓度的harpinZpsgSl虽然不能激发内眼可见的HR，但可以激发micro-HR。外施harpinZp。。s1可以促进烟草的生长，显著提高烟草对TMV和疫霉的抗性，而且抗性不仅局限于harpinZP。gsl处理的叶片，也包括其它未处理叶片及整株植物，是一种系统获得抗性。harpinZpsgSl激发的FIR伴随着HCD标志基因凰门Di，、凰乃J5的表达，同时伴随SAP．正调控因子朋唿J，植保素合成限速酶基因Pal，PR蛋白家族基因PR．1a、劬豇巧的表达，但未检测到乙烯信号通路的转录调控因子EIN2的表达，进一步说明harpinZPsgsl诱导烟草产生的SAR是依赖于水杨酸信号途径的。不同植物病原细茵产生的harpm虽然具有HR激发活性，但其在植物上的作用位点以及关键功能区域还存在一定差异。本研究为比较假单胞茵harpin类蛋白的结构和功能关系提供基础，为转基因抗病育种和新型微生物蛋白农药的研发提供基因资源．关键词：丁香假单胞大豆致病变种；harpm蛋白；GST基因操作系统；烟草过敏性反应：系统获得抗性II ABSTRACTCLONINGANDFUNCTIONANALySIS0FhrpZFROMPseudomonassyringaepv．glycineaABSTRACTPseudomonassyringaepv．glycinea(Psg)istheworldwideimportantplantpathogenicbacteriawhichcausedsoybeanblightdisease．Itbringstheheavylossesfortheagriculturalproduction．LikeotherGram-negativeplantbacteria,theyhavethehrpgeneswhichencodeharpinproteinsCanelicithypersensitiveresponseonnon-hostplantsandresistanthosts，andpathogenicityonhostplants．Atpresent,functionalstudyofharpinproteincodinggeneshrpZisrare，abroadonlyintheRace4andinthePsgr0strains，JianghaveclonedandexpressedhrpZinthePsgl2strain，whilethenucleofidehomologyofthesetwotypesshowed79％．SoweinferthathrpZfromdifferentpathovarsorstrainsofthesamespeciesaredifferent,theirencoded—harpinsmaybedifferentinstructuresandfunction．Ourlaboratoryhasisolatedandpurified7strainsofsoybeanblightdiseaseandfunctionalanalysisofthetypeIIIsecretedeffectors．Onthisbasis，thisresearchclonedhrpZfromA1andS1strains，named办咖JandhrpZvsgs2．SequencealignmentshowedhrpZofPseudomonassyringaepv．glycineacanbedividedintotwOcategories，aclassofhrpZvs州representatives，includinghrpZes912，othertothehrpZesgsl，includingthe缸够genesfromtheswainsofPsgr0andrace4．Thenucleotidehomologyofthesetwotypesshowed79％andtheproteinhomologyWas77％，whichcontainedabundantglycine(G)andLIHEKLGDNFGASA，buthadnocysteine(C)．ThisresearchrichhrpZgeneticresourcesfromPseudomonassyringaeandsupplytheresourcesofcountryhrpZfromsoybeanblightdisease．InordertounderstandthechemicalcharacteristicsofthegeneproductsencodedbyhrpZpse纠landhrpZesgsl，weexpressedharpinZvsgAlandharpinZpsgSlinEcoliandpurifiedharpirlZpsgSlthroughHigh-AffinityGSTResin．20mgpureharpinZpsgSlrecombinantproteincanbeproducedfromperliterbacteriasuspension．Purifiedharpinproteinprovidesamorefavorablebasisforfurtherstudyofitsstructureandfunction．Bioassayresultsshowedthat，thepurifiedharpinZv蹭SlWasheat-stable，sensitivetoproteaseK，andalsocouldtriggerI-IKintobaccoasotherknownharpins．Besides，theHRelicitationoftheproteinintobaccoWasdispelledbyeukayoticmetabolicinhibitors．ConcentrationgradientexperimentsdisplayedthattheminimalHR-elicifingconcentrationofharpinZpsgSIWaS100“g／ml，lowconcentrationofharpinZp踞SIcallnotelicitHR,butIII 丁香假单胞大豆致病变种却略基因的克隆及编码蛋白的纯化与功能的研究micro—HR．ExogenousharpinZpsgslcanpromotethegrowthoftobacco，significantlyincreasedtheresistanceoftobaccotoTMVandPhytophthoraaswellastheresistanceisnotconfinedtothetreatedleaves，includingotherleavesandthewholeplantswhichdefinedasystemicacquiredresistance．TheHRelicitedbyharpinZpsgslwasalongwiththeexpressionofHCDmarkedgeneshsr303jandhsr515，accompaniedexpressionbytheSARpositiveregulatoryfactorNPRl，phytoalexinsynthesisrate—limitingenzymegeneP文。PRproteinfamilygenePR—laandCh／a5，butdidnotdetecttheexpressionofethylenesignalregulatorytranscriptiOilfactorsE1N2，furtherincludedthattheSARinducedbyharpinZPsgslwasdependentonthesalicylicacidsignalingpathway．DifferentplantpathogenicbacteriaproducedharpincanelicitHR,buttherearestillsomedifferencesofitssitesactioninplantsaswellasfunctionaldomains．ThisstudyprovideabasisforcomparisonofstructureandfunctionofharpinproteinfromPseudomonas，geneticresourcesfortransgenicbreedingfordiseaseresistance，andalsoprovideabasisfortheapplicationfornewmicrobialproteinpesticides．Keywords：Pseudomonassyringaepv．glycinea；harpinprotein；GSTgeneoperatingsystem；hypersensitiveresponse；systemicacquiredresistanceIV 上篇文献综述 文献综述第一章植物的防卫反应和系统获得抗性第一章植物的防卫反应和系统获得抗性1植物．病原物的互作高等植物在充满生物的环境中生长发育和延续，随着共同进化而产生不同类型的病原菌．寄主植物关系。植物病原物，如真菌、细菌或病毒，各自采取不同的策略，以便能够成功地从寄主植物上获取营养，生存和繁殖。寄主．病原物的互作是一个复杂的过程，它以病原物接触寄主开始，以植物产生明显的感病或抗病的反应为止。寄主一病原物的最佳互作模式是植物受病原菌干扰后由于细胞膜透性的改变向胞外释放水分和营养而又不至于使细胞死亡。许多以毒素致病的病原物都能引起寄主植物细胞透性的变化为其在植物组织中定殖创造了有利条件。但就植物而言，植物病原物的侵染可诱导防卫反应引起过敏反应(hypersensitiveresponse，HR)，进而导致寄主植物组织局部坏死，阻止病原菌的扩散。按照互作类型寄主．病原物的关系主要分为亲和性互作(compatibleinteraction)和非亲和性互作(incompatibleinteraction)。亲和性互作是指病原物与感病寄主植物之间的互作，亲和性互作的结果导致植物感病。非亲和性互作是指病原物与感病寄主植物或非寄主植物之间的互作，非亲和互作的结果导致植物抗病。植物的HR就是植物与病原物非亲和互作最常见的表型(CoodManetal．，1994)。1．1病原物致病基因寄主．病原物互作分为亲和性互作(compatibleinteraction)和非亲和性互作(incompatibleinteraction)两类。其中植物病原菌中决定两种互作类型的基因分别称为决定亲和性的基因和决定非亲和性的基因。其中，决定亲和性的病原物基因包括编码致病生化因子的基因及编码逃避和克服寄主防卫反应的基因。广义地说，病原物的致病生化因子主要包括毒素(toxin)、胞外酶、病原物激素和病原物胞外多糖四大类。毒素和植物激素通过改变植物细胞膜透性，破坏细胞的正常结构，干扰寄主的正常生理活动。胞外降解酶对植物的直接作用是降解植物的细胞壁导致细胞死亡，问接作用是在作用于植物组织后释放有毒物质造成细胞死亡。逃避寄主防卫反应能力，主要指病原菌不被寄主识别的能力和转化寄主有毒防卫反应基因为无毒物质的能力。决定非亲和性的病原物基因包括决定病原菌小种对植物品种的不亲和基因和病原菌对非寄主植物的不亲和基因，前者称为无毒基因(avirulence，mr)，无毒基因编码特异性激发子，被寄主植物抗病基因(resistance，R)识别，产生抗病表型(Matthew,2000)。后者称为决定寄主专化性的基因，harpin基因的编码产物就是一类非特异性激发子，harpin蛋白与harpin蛋白的受体互作而属于非小种特异性的互作，产生抗病表型。 丁香假单胞大豆致病变种．jh弘z基因的克隆及编码蛋白的纯化与功能的研究1．2植物的先天免疫反应针对病原物产生的一系列致病基因，植物是如何应对的呢?与动物不同，由于缺乏像哺乳动物的移动防卫细胞和体细胞适应性免疫反应，因此依靠每个细胞的先天免疫力以及从感染点在植物内各处发送的信号来进行免疫(DanglandJones，2001；Ansubel，2005；Chisholmeta1．，2006)。植物的先天免疫反应是植物抵抗外界有害生物入侵的第一道防线。近年来分子生物学揭示，植物先天免疫系统包括两种不同的模式：第一种模式被称为病原相关分子模式(pathogergmierobial．associatedmolecularpatterns，PAMPs／MAMPs)激发免疫(PAMPs-triggeredimmunity,PTI)，即植物通过其细胞表面的模式识别受体(patternrecognitionreceptors，PRRs)对病原菌PAMPs的准确感知并防卫，最经典的例子是鞭毛蛋白(Flagellin)(ZipfelandFelix，2005)。第二种模式被称为病原菌效应子激发免疫(effector-triggeredimmunity,ETI)，这是因为有些致病力强的病原菌通过产生效应子(effectors)来抑制PTI，阻止植物对病原物分子特征的识别，于是植物就通过新的分子受体，如R基因编码的多种NBS．LRR蛋白质(DanglandJones，2001)来应对这些效应子并启动防卫反应。HighPTIEF8ETIETS盯Io生毒芑∞芍o"13三=△E《LowI：'athogeneffectors暑§◆⋯sThresholdforHR⋯⋯⋯⋯Avr．Ri-∞Thresholdforeffectiveresistance图1-1植物免疫系统拉链模式图(JonesandDangl,2006)Ftg．1-1Azigzagmodelillustratesthequantitativeoutputoftheplantimmunesystem(JonesandDangl，2006)随着病原菌致病基因和植物抗病基因的不断交替进化，促进了病原菌和植物基因组的共进化。Jones和Dangl(2006)依据当前植物先天免疫系统研究进展提出了一个四阶段的拉链模式(afourphased‘zig-zag’model)，为认识植物先天免疫系统提供了新的认识(图1．1)。 文献综述第一章植物的防卫反应和系统获得抗性1．3植物的防卫基因类型植物在利用先天免疫反应抵抗病原物侵染的同时，也会从感染点向内部各处发送求救信号诱导植物产生一系列的抗病因子，用来抵抗病原茵的致病因子，这类抗病因子称为主动抗病因子。寄主地病原菌侵染作出的主动反应，包括局部反应和系统反应。寄主的局部反应是指病症周围的细胞对后续的再侵染具有抗性，局部反应进一步激发整个植物的非特异性抗性，即系统获得抗性(systemacquiredresistance，SAP,)，表现SAR的植株对后续病原物的侵染具有更持久更广谱的抗性(Ryalseta1．，1996；Stieher酣a1．。1997)。植物的主动反应伴随着一系列细胞反应，包括胼胝质的积累、细胞木质化、积累富含羟脯氨酸的糖蛋白(m沿P)和外源凝集素等。植物受到病原真菌的侵染时就会在寄主植物细胞壁与原生质膜间形成乳突，具有抗病原物酶解和阻止病原物侵染和扩增的作用。同样，植物的主动抗病因素还引起一系列的生化反应，包括膜的变化、植物抗病基因的激活及与植物抗病直接相关的次生代谢产物的产生。植物的主要抗病因子主要有植物保护素(phytoalexin)、过敏反应(hypersensitiveresponse，取)、病程相关蛋白(pathogenesis．relatedproteins，PR)、同工酶(isoenzyme)、植物外源凝集素(1eetin)、创伤反应(woundresponses)、嗜铁素(siderophore)等。植物保护素(phytoalexin)是植物受侵染后产生的抗病原物的小分子化合物简称植保素，其产生速度和积累的量与植物的非特异抗病性相关。植保素抵抗真菌最有效，如大豆．大雄疫霉系统，有些也能抗细菌、线虫和原生动物。过敏反应(hypersensitiveresponse，HR)，植物病原真菌、细菌、病毒和线虫可以在非寄主植物或抗性品种上引发植物细胞死亡(hypersensitiveresponse。HCD)(Stakmaneta／．，1915)。过敏反应是植物受到病原菌侵染时产生的一种迅速的抗病反应，是寄主植物牺牲局部细胞而保护其他细胞的一种策略(Goodmaneta1．，1994)。过敏反应初期会引起植物细胞的一系列生化级联反应。植物细胞膜势能变化和发生离子流运动，是不同类型过敏反应的共同特点。已发现的过敏反应还伴随着呼吸、氧化还原状态和新蛋白质合成的变化，同时与组织衰老有关(Atkinsoneta1．。1985；BradleyetaL，1992)。进一步的研究结果表明，过敏反应伴随着防卫反应基因的活化。无论是非寄主植物过敏反应，还是品种特异性过敏反应，初期都会产生大量的活性氧，参与防卫信号的传递和转导。过敏反应与一般的病理学组织坏死的主要区别就是产生速度快，坏死组织颜色浅。过敏反应伴随着局部细胞死亡和与死亡细胞相临的活细胞的存在。因此，HR的重要特征就是包含细胞死亡和防卫基因的表达。但如何检测HR诱导的防卫基因的表达，以及如何在分子的水平上区分过敏反应与病原菌在寄主体内成功定殖引起的细胞死 丁香假单胞大豆致病变种卸z基因的克隆及编码蛋白的纯化与功能的研究亡呢?是科学家们一直研究的问题。直到二十世纪90年代，科学家们从烟草中找到了两个HR标志基因，^伽和胁，203J,他们发现将激发子harpin注射到烟草叶肉3．6h，hsr203J就开始表达，但HR表型12h后才开始显示。同时，胁r2DⅣ只在注射点周围表达，不像其他防卫反应基因可以在病原菌侵染的过程中系统表达(GopalaIleta1．，1996；Pontiereta1．，1994；Pontiereta1．，1998；Takahashieta1．，2004)。由此，人们才成功的区分了一般的病理学组织坏死和HR引起的过敏性细胞死亡。病程相关蛋白(pathogenesis-relatedproteins，PR)是植物在受病原菌侵染过程中诱导产生的一类低分子蛋白质，进而阻止病原的菌的再侵染。PR蛋白最早是在研究TMV与抗病烟草品种互作的过程中发现的。目前，已从多种植物中发现了PR蛋白，主要包括5类：PR-I、PR-2、PR-3、PR--4、PR-5。这几类PR蛋白中包含降解病原茵细胞壁的几丁质酶基因、抑制病害蛋白酶的蛋白酶抑制剂、与木质素和细胞壁木栓层形成有关的苯丙烷途径后期酶类等。在植物防卫反应中研究较多的是几丁质酶和p．1，3．葡聚糖酶，这两种酶在高等植物中广泛存在。病毒、细菌和真菌的侵染或激发子、胁迫、激素、乙烯处理都能诱导植物产生这两种酶。植物体内的几丁质酶基因主要包括5类：ClassI、ClassII、ClassIII、ClassIV和ClassV。按照氨基酸同源性可将植物内的几丁质酶基因可分为3类。ClassI几丁质酶基因可以和B．1，3．葡聚糖协同作用抵抗水稻纹枯病(Rhizoctoniasolani)的侵染。相反，ClassII类几丁质酶基因与ClassI不存在同源性，也不能降解病原真菌的细胞壁。研究人员发现烟草体内的ClassV几丁质酶基因还可以抵抗TMV的侵染(Melcherseta1．，1994)。同工酶(isoenzyme)是生物体中催化同一反应而结构不同的酶。在病原生物中研究了30多种同工酶。在寄主．病原物互作的机制研究中，同工酶主要用于寄主．病原物识别后的防卫反应研究。研究的主要类型有过氧化物酶(Catalase，CAT)、多酚氧化酶(Polyphenoloxidase，PPO)、葡萄糖．6．磷酸脱氢酶以及植物保卫素合成中的关键酶类。苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanineammonialyase，PAL)是苯丙烷类代谢途径的关键酶，它的活性与酚类化合物的合成密切相关。酚类物质本身具有抗菌素的性质，由酚类物质氧化而成的醌类物质是潜在的抗病因子。苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanineammonialyase，PAL)是苯丙烷代谢的关键酶，PAL主要影响木质素前体的形成。是植保素、木质素和酚类化合物合成的关键酶和限速酶，当植物被诱导后苯丙氨酸解氨酶活性明显增强，与木质素含量增加趋势吻合，并与系统获得抗性表达存在相关性。其活性通常被看成是植物防卫反应的指标(Manieta1．，1996；Thomaeta／．，2003)。 文献综述第一章植物的防卫反应和系统获得抗性2植物系统获得抗性植物系统获得抗病性(systemicacquiredresistance，SAg)是植物被一种病原物侵染后能对后续侵染产生广谱、持续和系统的抗性。用病原物弱毒株、非亲和菌株、一些化学物质或另一个病原物的接种寄主植物后，几天内能形成SAR，SAg可以持续数周、数月或是整个生长季不等。并且抗病性可扩展到整个植株，故称为系统获得抗性(图1．2)。图1-2SAIl反应中相关分子信号事件(Courath，2006)Fig．1-2SequenceofeventsassociatedwiththeestablishmentofSAR(Conrath，2006)植物产生SAg时，体内的一系列防卫反应基因会协同表达，用来抵抗病原物的后续侵染，这些基因称为SAR基因。同时，植物会对这些病原物产生记忆，我们称为‘'plantmemory'’，用来抵抗病原菌的再次侵染(Conrath，2006)。早期嫁接实验结果表明，植物是通过产生一种可以远距离移动的信号来诱导SAg的，但是，对于这种远距离信号的鉴定还不是完全清楚。一些研究认为SA是SAR中重要信号转导因子(Malamyeta1．，1990；M6trauxeta1．，1990；Shulaeveta1．，1995；M61dereta1．。1996)。对拟南芥dirl(defectiveininducedresistancel)突变体研究结果表明，DIRl与脂质转移蛋白具有较高的同源性，通过与脂类分子信号结合激活SAg信号通路(Maldonadoeta1．，2002)。与这一结果类似，突变拟南芥中EDSl(enhanceddiseaseresistancel，EDSl)和PAD4基因则丧失与脂类分子信号结合的能力，也不能 丁香假单胞大豆致病变种知弘z基因的克隆及编码蛋白的纯化与功能的研究激发SAR，这一结果暗示脂类分子信号对激活SAR信号通路的重要性。2．1水杨酸(SA)介导的SARKlessig等人(1991)从烟草上分离纯化出一种水杨酸结合蛋白(SA—bindingprotein，SABP)。SABP具有亲和性和结合专化性的特点，SABP仅能与SA及其类似物结合诱导SAR基因的表达和抗病表型的发生(ConrathetaI．，1995；Duetal．，1997)。从SABP分离出5个肽序列都与过氧化氢酶相同，纯化的SABP具有过氧化氢酶的功能，能高效地分解氧化氢。经cDNA克隆和序列分析表明它们所编码的蛋白就是过氧化氢酶。而SA及其类似物能抑制过氧化氢酶和抗坏血酸过氧化物酶的活性。因此认为，SA与SABP的结合是通过抑制过氧化氢酶和抗坏血酸过氧化物酶的活性，来促进更多H202的积累，H202和其它活性氧(ROS／ROIs)可能就是SA介导的SAR基于形成中重要的调控因子。而植物产生HR初期都会产生大量的活性氧，参与防卫信号的传递和转导，这进一步说明HR与植物防卫反应的关联。但H202在介导的SAR的作用机制仍然有很多尚未解决的问题。植物在受到病原菌侵染时，体内的H202含量会升高，在局部组织出现氧爆发现象，通过一系列的信号传递诱导植物产生SAR，从而抵抗病原菌的再侵染。但当H202和其它活性氧(RoS／RDIs)含量过高时，也会对植物组织造成伤害，如膜脂过氧化，导致膜系统受损，从而引起植物体内产生一系列的生理生化反应(Thomaetal．，2003)。因此，就需要植物体内的活性氧清除系统，如超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase，SOD)和过氧化物酶(Peroxidase，POD)系统。另有研究表明，植物细胞壁结合的受体激酶Walk的表达可以激活植物体内的活性氧清除系统，避免活性氧含量过高对植物造成的伤害(Heeta1．，1996；Kohometa1．，2001)。目前，虽然对于SAR中这种远距离信号的鉴定还不是很清楚，但大量实验结果表明水杨酸(SA)作为一种内源信号分子在SAR中起着重要的作用。SA的类似物苯丙塞重(benzothiadiazol，BTH)和二氯乙酰胺(2，6．dichloro—isonicofinieaci正INA)作为一种化学信号分子同时具有诱导SAR的作用。研究人员们从恶臭假单胞(Pseudomonasputida)中克隆到NahG基因，该基因编码产物为SA羟化酶，该酶可以将SA中的羧基转化为羟基，进而将SA转化为无活性的儿茶酚。他们又将NahG基因转化野生型烟草得到NahG转基因烟草，该转基因植株在受到TMV侵染后不积累或很少积累SA，也不能产生SAR，并且转基因植物促进感病性的现象并不只对TMV，对其他真菌病害如烟草黑胫病(Phytophthoraparesitica)和细菌病害如(Pseudomonassyringaepv．syringae)也是如此(Gaffneyetal．，1993)。用SA类似物苯丙塞重(benzothiadiazol，BTH)6 文献综述第一章植物的防卫反应和系统获得抗性和二氯乙酰胺(2，6．dichloro—isonicotinicacid，烈A)处理转基因植物，可恢复NallG转基因烟草SAR的表型和SAR基因的表达能力(Delaneyeta1．，1994)。在拟南芥与霜霉病的抗性研究中发现，如果抑制PAL基因的表达或生物活性，则拟南芥对霜霉的抗病转化为感病(Mauch．Manietal．，1996；Pallasetal．，1996)。因为PAL是水杨酸生物合成的限速酶。然而，PAL酶活性可以由创伤或者各种生物和非生物胁迫因子诱导，但SA的积累是特异性的HR和SAR反应相联系而不是一种创伤反应。因此，PAL酶活性大小不是SA积累的唯一决定因子。可能与木质素和植物保护素的合成相似。SA的积累实际上是苯丙烷途径中许多酶类共同作用的结果。此外，植物体内SA的积累与酸性PR蛋白之间也是密切相关的。实验证明，在感病的拟南芥中，无SA的积累，也没有PR蛋白的表达(Olazebrooketal．，2001)。那么SA信号是如何向下游传导呢?这一过程是需要哪些调控因子呢?第一依赖于NPRl基因，在拟南芥上的研究表明NPRl舢是SA信号传导途径中的重要调控因子。对拟南芥NPRl／NIMl突变体研究结果表明，突变体植株对病原真菌和细菌的侵染表现出高度的敏感，对SA不敏感。外源使用SA及其类似物也不能恢复抗病表型，也不能增强SA诱导的SAR基因表达，因此研究人员认为NPRl／NIMl是在SA累积下起作用的(Delaneyeta／．，1995；Ryalseta1．，1997)。Zhang等人(1998)成功将NPRl转入烟草中，转基因植株可以提高对细菌和卵茵的抗性。这也是第一例将抗病信号传导调控因子应用于转基因抗病育种中。上述结论说明NPRl／NIMl是SA传导的正向调控因子。但就其是如何激活SAR基因的表达的还有待研究。Despres等人(2000)用荧光标记实验证明NPRI定位于细胞核中，这对它诱导艘．J基因的表达非常重要(Dongeta1．，2001)。在细胞核内，NPRI通过与转录因子互作的方式调控艘．．f基因的表达，这一发现将NPRI和艘．，基因的诱导表达直接联系起来。对SA信号通路受损的拟南芥突变体进行研究，发现在一些诸如cpr6(constitutiveexpresserofPRgene6，cpr6)突变体中，可能存在一条依赖SA而不依赖朋飧J的抗性信号通路。但用SA和BTH处理nprl突变体则不能恢复突变体的表型和对病原菌的抗性(Dongetal．，2001)。因此依赖SA不依赖朋哏．『的抗性机制需要第二个信号，这可能有细胞死亡提供，如活性氧、NO等。乙烯和茉莉酸信号通过不依赖NPRl的通路加强了信号。总之，SA介导的SAR过程主要包括SA信号的接受、SA信号的传导、传导过程中的调控以及SAR基因的表达与抗病表现产生等，还伴随着其他信号通路的开启以及交叉对话，是一个复杂的过程(图1．3)。 文献综述第一章植物的防卫反应和系统获得抗性2．2植物的过敏反应与系统抗病性的关联植物的过敏反应与系统获得抗性之间是存在一定关联的，表现为功能上的一致性以及时间上的顺序发生。在植物与病原菌共同进化的过程中，植物不断地衍生出一套抵抗病原茵侵染的应激策略。其中，植物中普遍存在的抗病机制有两种，过敏反应(HR)系统获得抗病性(SAR)，因此二者在不同植物与病原菌互作的过程中表达的内容是一致的。同时，过敏反应(HR)系统获得抗病性(SAR)在发生时序上又存在一定的先后性。植物受病原菌侵染的最初3．6h内HR标志基因开始表达，24h内出现细胞局部的快速主动死亡，将病原菌限制在坏死细胞内，阻止病原菌的繁殖和扩展，随后SAR基因如PR蛋白相关基因被诱导表达，感染一周左右，植物整株获得SAR，可以抵抗病原菌的再次侵染，甚至对其它病原真菌、细菌、病毒和线虫均有很强的抗性。由于SAR发生在HR之后，因此PR蛋白基因的表达成为HR和SAR发生的分子标志。 文件综述第二章植物病原细菌中的harpin类蛋白研究进展第二章植物病原细菌中的harpin类蛋白研究进展1已报道的harpin类蛋白及其生物学效应1．1harpin蛋白的生物学效应革兰氏阴性植物病原细菌可以在非寄主植物和抗病植物上激发过敏反应(hypersensitiveresponse，HR)，在感病寄主上具有致病性(pathogenicity)，这一特性由细菌中hrp基因簇决定(Lind铲enetal．，1986)。hrp基因簇的特定基因编码产物harpin是一类可以在非寄主植物上激发HR．的非特异性蛋白质激发子，是目前研究得较为深入的一类细菌分泌蛋白。harpins蛋白的共同理化特征是：对热稳定，对蛋白K敏感，具有I-IR的功能域，可以在非寄主植物和抗病植物上激发过敏反应，并且过敏反应可以被真核生物代谢抑制剂抑制(Weieta1．，1992)。序列分析发现，harpiIls均富含甘氨酸(Gly)，少量(或不含)半胱氨酸(Cys)。harpins是受特定的hrp基因调节并通过IⅡ型泌出通道被运输到植物细胞内，在病原细菌侵染植物的过程中，harpin通过形成特定的离子通道将植物病原细菌的III型效应分子源源不断地注入到植物细胞内。除harpinp娼外，其他harpin均可以作为病原细菌的毒性因子起作用(Galbnetal．，1999；Staskawiezeta／．，2001)。SteFan等人(2009)对来自Psyringaepv．phasiolicola的最新研究结果表明，mpZl同时还是一类PAMP(pathogen-associatedmolecularpattern)分子参与植物的先天免疫反应。植物通过其细胞表面的模式受体(pattemrecognitionreceptors，PRRs)对病原菌的PAMPs准确识别进而诱发PTI(PAMPs．triggeredimmunity,PTI)。研究人员发现HrpZl及harpin家族其他成员如mpN、PopA均具有形成离子通道的功能，但只有rt,-pZl还具有PAMP分子的特征，这一结果说明离子通道的形成对诱发PTI不是必须的。为了进一步研究i-hpZl的哪段独立功能区域可以同时负责孔的形成与激发PTI，研究人员构建了3个HrpZl突变体，分别为arpZl(aa1-80)、mpZl(aa100．200)以及HrpZl(aa201-345)。实验结果表明，相对于nrpZl全长，3个突变体片段均不能再形成离子通道，RT-PCR显示HrpZl全长和HrpZlC．末端201．345位氨基酸片段可以激活丝裂原活化蛋白激酶(mitogen．activatedproteinkinase，MAPK)活性以及诱导艘基因的表达，HrpZl中部100-200位氨基酸片段则不能，HrpZlN．末端201．345可以激活MAPK活性但不能诱导艘基因的表达以及植保素的合成。这说明，i-hpZl全长对于孔的形成是必须的，但对于激发PTI则不是必须的，激发PTI的最小活性区域是mvZlC．末端201．345位氨基酸。 丁香假单胞大豆致病变种—切亿基因的克隆及编码蛋白的纯化与功能的研究1．2植物病原细菌中的harpin类蛋白harpins是一类广泛存在于植物病原细菌中的分泌蛋白。1992年，韦忠民首次从梨火疫(Erwiniaamylovora)d?离得到一种能引起过敏反应的蛋白激发子命名为mpN，随后harpin在所有常见的革兰氏阴性植物病原细菌中得到了鉴定(表2-1)。表2-1已报道的部分harpin蛋白Table2-1PartialharpinshavebeenreportedErwiniaamylovoraHrpNF．Weieta1．，199244kDampWKimandBeer,199845kDa、E．carotoWrasubsp．carotovoraHrpr4EccBauer甜耐．，199536kDaKchrysanthemiH州鼬Baueretal，199536kDaPsuedomonassyringaepv．g(ycineaHrpZp罐Prestoneta1．，199535．3kDaP．syringaepv．phasiolicolaHrpZPIphPrestonetal．，199535kDaPsyringaepv．syr／ngaeHrpZpnHeeta1．，199334．7kDaHrpW陬Charkowskiet口f’199842．9kDaP．syringaepv．tomatoHrpZr．Prestoneta／，199536．4kDaRalstoniasolanacearumPopAArlateta1．，199436kDaXanthomonas．campestrispv．vesicatoriaHpaGWengelinketa1．，199652．5kDa上oryzaepv．oryzeaHarpinxo。weneta／，200115．3kDaX．oryzaepv．oryzicolaHarpinx,cWanef口f，200113．4kDaZaxonopodispv．glycineaHpa瓯一Kimeta1．，200313．4kDaX．oorzaepv．oryzicolaHl'ab㈨Zoueta1．，200613．4kDaP．syringaepv．glycineaI-IrpZr碍12姜兆远等，200934kDaRalstoniasolanacearumPopWLieta1．，201044kDa丕：翌221丝2兰!E凼丝望!业￡j!丝型：：兰Q!!!§堕!在现代植物病原细菌harpin蛋白研究过程中，将具备harpin共同特征的一类蛋白归为ha叩i11家族成员，根据harpin的等电点、核苷酸和氨基酸数目、甘氨酸(Gly)和半胱氨酸(Cys)含量、氨基酸保守序列及其分布情况等，将harpin家族分为三个组群。第一组群是来源于黄单胞菌的harpin蛋白，如Harpinx¨Hpalxooc、HpaG)吨I等，其共同特征：等电点3．6．3．9；核苷酸为400．420bp：Gly含量20-25％，含少量(或 文件综述第二章植物病原细菌中的harpin类蛋白研究进展不含)Cys；具备保守的功能序列QGISEKQLDQLL和ILQAQNGGG。第二组群是来源于欧文氏杆菌、斯氏范泛菌和果胶杆菌的harpin蛋白，如HrpNEa、HrpNEcc、HrpNp赋等，其共同特征：等电点4．2．6．4；核苷酸1000．1300bp；Gly含量15．23％，不含Cys：具备保守的功能序列GQFMDQYPE和PDDDGMT。此外，还有来源于假单胞菌和青枯劳尔氏菌的HrpWp如和PopARso也属于此组群。第三组群的成员是来自假单胞的harpin蛋白，如I-IrpZv辨HrpZPsta、HrpZp鲢、HrpZp或等。其共同特征：等电点3．8-4．1；核苷酸1000-1300bp,Gly含量相对第一组群和第二组群较低，8．18％，不含Cys=具备保守的功能序列LIHEKLGDNFGASA。生物信息学分析发现，harpin蛋白在在不同属间同源性低而在同一个属下不同致病变种间同源性较高。这一分类方法为进一步研究不同植物病原细菌harpin蛋白的结构和功能提供了基础(何晨阳等，2009)。2harpin蛋白的分子结构特点2．1harpin蛋白在植物上的作用位点由于植物病原细菌产生的harpin蛋白可以通过与植物发生非亲和互作，进而诱导HR产生及一系列防卫反应的发生，那么harpin蛋白是如何与植物特定部位的受体识别的就成为后续信号传递的前提内容。因此，关于harpin蛋白在植物上的作用位点以及克隆相应的受体蛋白成为倍受人们关注的问题。Hoyos等人(1996)首先证明harp吣。。的作用位点在细胞壁上，并且harp吣鹞与细胞壁的结合需要Ca2+离子参与。作用在细胞壁上信号可能通过两种方式传递给细胞膜，然后再向细胞内传递。一种是通过Wakl(wall．associatedkinase)另一种是PCC(plasmalemmacontrolcenter)模型(Pickard)。Tampakaki等人(2000)依据转基因表达的harpinpsph分子在烟草组织内的分布发现harp吣sph只有在信号肽的引导下才能行使HR的功能，这说明harpinwph在烟草上的作用位点位于细胞外。Li等人(2009)从青枯劳尔氏菌ZJ3721中鉴定了一个39kDa的新胞外蛋白PopW，它具有harpin蛋白的性质，在一级结构上PopW是由两个结构域组成，包括harpin结构域和果胶酶结构域，将PopW和GFP荧光标记基因融合表达，转化洋葱表皮细胞中检测其作用位点在植物细胞壁上。上述两种结论均表明harpin蛋白的作用位点在植物细胞膜外，但Lee等人(2000)发现来自只J．pv．phasiolicola的harpinPsDh蛋白通过和脂质体以及人工合成的双层膜稳定结合，打开一种离子通道，允许阳离子通过，而Cr等阴离子不能通过。进一步研究发现，harpinpsph还可以同烟草的微粒体膜和原生质膜特异结合，并且这种结合显示出饱和性和可逆性。harpinpsph与质膜的结合可以诱导HR标志基因hinl和职蛋白的表达。因此，他们认为harpin蛋白的作用位点在植物细胞膜上。 丁香假单胞大豆致病变种幻够基因的克隆及编码蛋白的纯化与功能的研究Miao等人(2009)对转基因棉花中harp协xo。进行了免疫胶体金标记，结果显示，只有在转基因棉花细胞壁中发现具有差异性的胶体金含量，在细胞膜中迸发现少量的，在叶组织和茎间的线粒体中并未发现。因此，他们认为harpinxoo在转基因棉花中主要分布位于植物的细胞壁上。上述结果表明，不同的harpins在植物上具有不同的作用位点，这也从侧面说明，不同harpins可能有不同受体，或同一种harpin可能有不止一个受体。特异性受体“R，’接受特异性信号(AVR)，非特异性受体接受非特异性信号如harpin、Elicitin、SA和毒素等。一般来讲，受体有三种类型即离子通道型受体、蛋白偶联型受体和具酶活性受体型。多离子通道型受体亚基组成的受体／通道复合体，既接受信号，又是离子通道。跨膜信号传递不需中间步骤，反应快与配体结合后，通过变构作用，打开离子通道，细胞内外离子交换，使K+外排，矿、Ca2+内吸，造成胞外碱化。HrBPl(hypersensitiveresponseelicitorbindingprotein1)是拟南芥中第一个被克隆到的harpin受体蛋白，该蛋白分子量大小约为30kDa，并且，在番茄、烟草、等十几种不同植物中均克隆到了HrBPl的同源序列，这也从某种程度上解释了harpins多效应的原因(Songetal．，2003)。随后Chug．Sik等人(2007)采用同样的酵母双杂技术发现了一个与酬互作的受体蛋白，命为为HIPM，通过与rtrpN的特异结合，激活乙烯／茉莉酸途径，进而促进植物生长。包志龙从烟草中克隆了3个受病原细菌诱导的反应元件，PPPl、PPP2和PPP3，PPPl和PPP2还含有受生物激发子和SA诱导的反应元件，将它们与含有GUS基因的植物转化载体pBll21上的35S启动子进行替换，转化烟草和拟南芥得到稳定整合的转基因植物。通过GSU染色来检测上述3个启动子的活性。实验结果表明，PPPl、PPP2和PPP3在接种青枯劳尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)后都可以被诱导表达。随后，他们有用SA、harpinxoo以及3个具有诱导抗虫、诱导抗病和促进生长的harpinxoo短肽，喷雾处理转基因植株，发现PPPl、PPP2均可以被诱导，而PPP3不能被诱导。这进一步说明，harpins在植物上的多重效应是通过特异的功能区域与植物PPPs中相应的顺式作用元件之间的相互作用来实现的，而且顺式作用元件与harpin功能域的对话可能决定了harpins在植物上起何种效应。目前，有关harpins在植物上的作用位点和受体还不是完全清楚，近两年，有报道用harpin蛋白的类似物去研究harpin蛋白的作用位点(Chelaeta1．，2009)，可能会为研究此类问题提供新的思路，但具体问题还需要大量的实验加以证明。14 文件综述第二章植物病原细菌中的harpin类蛋白研究进展2．2harpin蛋白的关键功能域研究不同植物病原细菌产生的h龇-pin虽然具有m之激发活性，但其调控HR的功能区域还是存在一定差异。随着分子生物信息学技术的不断发展及蛋白质构象研究技术的不断更新，对于harpin蛋白功能域研究成为越来越多科学家研究的重点。迄今为止对于丁香假单胞茵菜豆致病变种Psyringaepv．phaseolicola功能域的研究最为透彻。Li等人通过构建一系列mpz突变体蛋白对Psyringaepv．phaseolicolampz的功能域进行定位，认为C．末端具有调控HR的功能，N．末端的最远含有TTSS的分泌信号，高度保守的中部具有多肽结合位点，N．末端及C．末端与原生质膜脂类的结合及孔道的形成有关，但在丁香假单胞大豆致病变种中还未见报道。steFall等人(2009)的最新研究结果表明nrpzC．末端同时具有形成离子通道与激发PTI的活性。相对于只syringae，在Xanthomonasoryzae中HR的激发能力是由N端小螺旋结构(a-helix)决定的(Arlateta1．，1994；Leeet以，2001；WangetaL，2008)。目前，国内对于Xanthomorla$oryzae的HR功能域进行了大量深入的研究。李平等人(2002)构建了5个harpinx僦缺失突变序列表达载体，通过大肠杆菌体外表达验证其生物学功能，结果表明，不同harpinx咖缺失突变体多肽可以在不同植物上引起HR和致病的不同的表型。郭晓静(2004)构建了13个harpinx晰缺失突变序列表达载体，并测定了harpinX蛳和13个突变体多肽在烟草和拟南芥上的不同功能。结果发现haIpinx啷蛋白引起HR的功能区域主要位于N端的，突变半胱氨酸以及缺失甘氨酸重复序列均对HR活性没有明显的影响。缪卫国(2009)克隆了Xanthomonasoryzae中N端a．螺旋区域的两段七肽重复序列，通过体外表达证明了其在烟草上的HR反应，如果在．厂点亲水苏氨酸(threonine)换成色氨酸(cysteine)，或者将C点疏水蛋氨酸(methionine)换成谷氨酰胺(glutamine)，则降低了(a-helix)形成的几率，诱导烟草产生HR的能力也降低。因此，他们认为在Xanthomonasoryzae中tz-helix形成决定了harpin在非亲和互作中激发的HR反应。纪兆林(2010)通过大量的生物信息学分析和预测，初步证明了harpill轴具有两个ot-helix二级螺旋结构和少量的转角结构，并通过人工化学合成的方法合成了具有生物学功能的harpinxoo短肽，其中包括GGG．GG重复序列，通过转化烟草对其功能进行研究，证明其与外施harpin一样可以诱导烟草抵抗病原菌的侵染。来自区amylovora和只s．pv．tomato中的rtww是除脚Z以外的harpin蛋白，hrpW蛋白存在两个功能域，包括N．末端159个氨基酸的HR功能域，具有在非寄主烟草上激发HR活性，以及C．末端207个氨基酸组成的果胶酶的结构域，但不具有果胶裂解酶的功能(Charkowskieta1．，1998；Gaudriaulteta1．，1998)。青枯劳尔氏菌(Ralstonia 丁香假单胞大豆致病变种胁硝：基因的克隆及编码蛋白的纯化与功能的研究5D，I嬲n口ce口Ⅲm)中的P叩w和脚W存在同源性，同时具有两个功能域(Lietal．，2009)。目前，虽然很多功能片段都已经被克隆表达，并验证其功能，但在田间生产中的应用还有待进一步实践。相对表达全长来说，短肽片段更易于体外表达，节约成本，会更利于微生物蛋白农药的产业化。3harpin蛋白诱导植物防卫反应的分子机理3．1harpin蛋白激发HR的信号通路以往研究表明，外用harpin蛋白可以使植物获得多种有益表型，包括对病原菌的广谱抗性、促进植物生长和发育、诱导植物产生抗虫性、增加植物根干物质积累、增加净光合量、减少作物产后损失等。其原因就在于harpin可以诱导多种抗性机制，激活多条信号通路，但是植物体内的信号通路途径似一个复杂交织的网络，harpin蛋白可以诱导植物启动哪些信号通路以及这些信号通路间是否存在交叉对话呢?起初，人们发现harpin可以在非亲和互作中激发植物产生HR，HR的过程中伴随着植物活性氧(ROS)迸发、钙离子通道变化、水杨酸(SA)积累、SAR基因的表达等(Desikaneta1．，1998；Desikaneta1．，1999；Dongeta1．，1999；XieandChela，2000；Andieta1．，200l；Desikan甜a／．，2001；Maaroufeta／．，2001；Dongeta／．，2004；Racape甜aL，2005；陈功友等，2005)。后来，经过大量的实验证实，harpin至少可以激活三条以上信号通路，不同的信号通路介导了不同的生物学效应。其中水杨酸诱导植物抗病防卫，乙烯诱导植物抗虫和加快生长，脱落酸诱导植物抗旱(图2-1)。16 文件综述第二章植物病原细菌中的harpin类蛋白研究进展囝～嚣●上P2mo上o●P5●P6SaIlc们lcJasmonicAbSCiSiCH：02aci8acidEthyleneacid上山上山TTGlNDRlJARlbETRlABH。EDSl◆山ABl2上、L上cTl／＼上IbEIN2EIN5l◆+山上∑Z占．NPRlCOtlbERFlA8F◆上’＼上上Z∑上刍寥皆簪皆魏簪ha_,'pinEa可以有效提高拟南芥对PJ．pv．tomato和Ps．pv．parasitica烟草对TMV的抗性(Dongeta1．，1999)，进一步研究发现，harpinEa不能诱导突变体NahG和nprl中PR-J(Dongeta1．，1999；StrobcletaL，1996)。青枯劳尔氏菌(Ralstoniasolaanacearum)导的SAR，不涉及乙烯／茉莉酸途径(“etal．，2009)。此外，harpiIlx∞或harpiIl飙处理烟草可以诱导烟草对TMV、黑胫病(聊tophthoraparasiyicavat．nicotianae)、赤星通过多年田间实验证明harpinEa可以诱导40多种作物对20多种虫害的抗性。用harpinEa秘棼：A．鼍。◆雕 丁香假单胞大豆致病变种hrpZ基因的克隆及编码蛋白的纯化与功能的研究处理拟南芥后，可以显著降低蚜虫的出生率、繁殖速度和繁殖数量，但这种抗虫效应是在在蚜虫移入处理的植物上3天后才表现出来，进一步说明harpinEa不是直接作用于蚜虫，而是间接地通过诱导植物的一些防卫机制起作用的(Dongela1．，2004)。RT-PCR结果表明，harpinEa处理拟南芥24内，乙烯／茉莉酸信号通路的标志基因尸：DF，．2和乃f2．J均出现上调表达，48h有所下降，96小时下降至未处理水平，harpinm处理茉莉酸通道突变体iarl和拟南芥不敏感突变体ein2后，这些反应都受到不同程度的抑制，表明harpinEa可以通过启动．W乙烯信号通路来诱导植物产生有益表型(Qiueta1．，1997；Weieta／．，1998)。彭等认为，harpinEa是通过激活乙烯信号通路及其下游分支，分别引导植物生长加快(enhancedplantgrowth，EPG)和抗虫性(insectresistance，IR)表型，EPG和瓜与SA信号通路无关。田间施用用SpaGx00。和SpaGxoo的活性短肽可以提高水稻的产量(Reneta1．，2006；Cheneta1．，2008a；Cheneta1．，2008b)。此外，harpin可以提高植物的开花率和座果率，通过促进植物的生长发育缩短收获期，系统的影响植物的整个生活史harpin可以通过启动ABA信号通路诱导植物抗旱。ABA启动植物体内抗逆基因表达的“第一信使”，可有效激活植物体内抗逆免疫系统，增强植物综合抗性(抗旱、抗热、抗寒、抗病虫、抗盐碱等)的能力。对农业生产上抗旱节水、减灾保产和生态环境的恢复具有重要作用。目前，harpin蛋白应用在诱导植物抗胁迫能力方面的报道较少。在干旱胁迫条件下，使用harpiIlx。o喷雾处理烟草，发现harpinx∞能促进植株气孔关闭、诱导脯氨酸和ABA积累，保护植物细胞质膜免受损伤，并且该过程伴随着ABA信号通路中关键基因osmotin．pkll-cl和phi-2的表达(姚祯，2004)。最新研究结果表明，内源表达harpin编码基因也可以诱导植物产生耐早性，内源表达而桕诱导水稻植物ABA浓度的生高，促进气孔关闭，保水能力增强，脯氨酸和可溶性糖水平显著升高。通过eNDA芯片技术分析了超表达矗班基因水稻植株的表达谱，并找到了225个差异表达基因，其中包括多个与耐旱性和抗病性相关的基因，通过对这些差异表达基因的分析发现，内源表达办坍基因在水稻中调控的耐旱性和抗病性信号通路可能存在交叉对话(Zhanget以，2011)。3．2harpin蛋白激发的HCD信号通路与抗病之间关系harpin注射到烟草叶肉细胞或处理烟草悬浮细胞，都会诱发HR，并且可以诱导HR标志基因办伽和hsr2何的表达(Dongeta1．，1999；Strobeleta1．，1996)，低浓度的harpin喷雾处理烟草虽然不能激发肉眼可见的HR，但可以诱发micro—HR反应，显微镜下可以明显的观察到坏死细胞被染成蓝色。harpinx0。在烟草体内表达，可以提高烟 文件综述第二章植物病原细菌中的harpin类蛋白研究进展草对TMV、R．solanacearum和彳．alternata的抗性，但harpinxoo在烟草体内表达并不能激发HR(Pengeta1．，2004)。包志龙等人发现将来自Xanthomonasoryzae的harpin编码基因harpinxoo转入烟草中，可以诱导SAR基因的表达，赋予转基因植株抗病的表型。但在转基因烟草整个生命周期内都不自发产生HR，甚至连micro-HR也没有发生，并且HR标志基因hin和凰r203j也没有表达。这都与外用haroin的作用效果恰恰相反。Racape等人(2005)在研究转popA基因的烟草HR活性时发现转基因烟草的HR表型与PopA在细胞质膜上结合有关，harpins可以调节质膜上不同的离子通道，而后又与HCD相关联。上述研究结果均表明不同来源的harpin蛋白在不同植物中表达均可以赋予转基因植物优良的性状以及广谱的抗性，但与外用harpin不同的是这一过程不能诱导HCD的发生。这就进一步说明harpins诱导的抗病信号通路和HCD信号通路可能各行其道又在某一环节产生交叉对话。4harpin蛋白在实际生产中的应用4．1harpin蛋白在基因工程中的应用随着现代分子生物学技术的高速发展，转基因技术(Transgenetechnology)应运而生，在帮助解决粮食安全问题、减缓环境影响以及提高粮食生产的可持续性方面都可发挥重要作用。自1983年首例转基因烟草问世，至今全球已有120多种植物获得转基因植株。目前已有大量实验结果表明，应用转基因技术将编码harpin蛋白的基因导入植物中，内源表达harpin蛋白的转基因植株能被诱导出与外源施用harpin时相同的有益表型。本实验室前期已成功将水稻细条斑病菌(Xanthomonasoryzaepv．oryzicola)harpin编码基因ha印inX咖转到油菜中，转基因油菜后代具有优良的农艺性状并且可以有效提高对油菜菌核病的抗性(HuoetaL，2009)。有意思的是，将来源梨火疫病菌的harpinz。导入梨中，转基因植物后代对梨火疫病也产生了较强的抗性(Malnoyetal．，2005)，这一现象目前还没有很好的解释。转hrpN的马铃薯可以有效提高对马铃薯疫病的抗性(李汝刚等，1999)。转hrfl基因的棉花激活了H202介导的抗病信号通路，增强了棉花对黄萎病和棉铃虫的抗性(缪卫国，2009；Miaoeta1．，2010a；Miaoeta／．，2010b)。hq7基因在水稻中组成性表达，可以诱导水稻耐旱性和抗病性相关的基因的表达，有效抵抗逆境的胁迫(Zhangeta1．，2011)。目前，harpin编码基因应用在转基因抗病育种中的实例还有很多，转基因植株可以正常生长发育，并未见对植物自身有害的表型出现。但就其遗传稳定性及转基因食品质量安全问题还有待进一步的评估(李先平等，2002)。本实验室前期成功研制了载harpinx㈣蛋白纳米粒，其制备条件缓和、工艺简单、 丁香假单胞大豆致病变种纫眩基因的克隆及编码蛋白的纯化与功能的研究包封率较高，具有缓释效应，并且能后诱导烟草产生过敏反应促进烟草植株的生长(湛江等，2009)。Liang等人(2009)发现将Ps．pv．tomato的重组蛋白附于载体纳米颗粒乳酸聚7．--醇共聚物上，有助于HrpZ进入烟草叶片的表皮层和细胞壁，增加HR活性以及诱导SAR基因的表达。4．2harpin蛋白在微生物农药研发中的应用微生物蛋白农药是对多种农作物具有很强生物活性的一类蛋白质药物，按照作用机理的不同又可分为传统微生物蛋白农药和新型微生物蛋白农药。传统微生物蛋白农药主要是来自苏云金芽孢杆菌(Bt)的杀虫晶体蛋白(ICP)，其作用机理是直接杀灭害虫和病原物。新型微生物蛋白农药主要是蛋白激发子类物质，它与传统微生物蛋白农药最大的区别在于其不是直接杀灭害虫和病原物，而是通过激发植物自身的抗病防虫基因的表达，并促进植物的生长发育。目前研究报道的具有代表性的新型微生物蛋白农药主要有过敏蛋白(Harpin)、隐地蛋白(Cryptogein)和激活蛋白(Activator)等，其中最受关注、最有应用前景的是harpin类蛋白激发子。可以说harpin蛋白一经发现了就推动了新型微生物蛋白农药研究的兴起，经过约lO年的努力，美国Eden公司率先成功研发具有广谱抗病防虫功能的新型微生物蛋白农药Messenger，并注册上市。该产品以其对大田作物和经济作物抗病增产方面良好的效果以及对绿色无公害农业卓越的贡献，曾两度获美国环境保护委员会颁发的总统绿色化学挑战奖。国内对于harpin类微生物蛋白农药的研发也进行了大量实践。本实验室前期通过建立枯草芽孢杆菌高效分泌表达harpillx雠蛋白体系，研发了一种新型广谱抗菌的生防制剂，田间试验结果表明，其可以有效提高大豆对根腐病的抗性。目前，已获得专利许可的有来自Xanthomorlasoryzae、Psyringae、Ralstoniasolaanacearum和Eamylovora的harpin蛋白，田间试验证明来源不同的harpin蛋白均可以诱导多种作物对病原菌的广谱抗性。hardin蛋白在田间实验的防治效果相对于化学农药略低一些，由于其作用机制不是直接杀灭害虫和病原物，相对于化学农药显效要慢一些，同时，研发成本也会相对较高一些，因此，在生产实践中的广泛应用还有待提高。但由于其对环境及人类友好，未来可望成为逐步替代高毒、高残留的化学农药。 下篇研究内容 研究内容第一章丁香假单胞大豆致病变种harpin编码基因的克隆与表达第一章丁香假单胞大豆致病变种harpin编码基因的克隆与表达摘要；采用PCR方法从丁香假单胞大豆致病变种(Pseudomonassyringaepv．glycinea)A1和S1菌株中分别克隆到大小为1026bp和1038bp的hrpZ基因，构建于表达载体pET41a(+)上，并转化大肠杆菌BL21，IPTG诱导表达后，SDS．PAGE显示其表达产物为分子量62kDa的融合蛋白质，harp“酝gAl和harpinzPsgSl的分子量约为35kDa。序列分析确定harpinZpsgal和harpinZv。gSl属-于harpin家族第三组群，假单胞组群。通过生物信息学分析，可将来自丁香假单胞大豆致病变种hrpZ基因可分为两类，一类以hrpZessal代表，包括hrpZPs912，另一类hrpZesgsI代表，包括来PsgrO和Race4菌株的hrpZ基因。这两类hrpZ基因的核苷酸同源性为79％，氨基酸同源性为77％，均富含甘氨酸，不含半胱氨酸，富含保守的LmEKI．GDNFGASA功能序列，与假单胞菌属以外的其他革兰氏阴性植物病原细菌不存在相似性。关键词：丁香假单胞大豆致病变种；hrpZ；原核表达ClONINGANDEⅫRESSINGANHARPIN．ENCODINGGENEFROMPseudomonasSyrmgaepv．glycmeaAbstract：WeamplifiedthehrpZgenes脚Pseudomonassyringaepv．glycineaisolateA1andS1genomieDNAbyPCRtechnique，thesizewere1026bpand1038bp．ThefusionharpinproteinwasexpressedinE．coliB121andWaSinducedbyIPTG．TheSDS-PAGEgelshowedthatfusionproteinwas62kDa，themolecularmassofharpinZpsgAlandharpinZpsgsIWere35kDa．SequencealignmentshowedharpinZpsgAlandharpinZpsgslbelongedtothe廿1确groupofharpinfamily,Pseudomonasgroup，besidesthehrpZofPseudomonassyringaepv．glycineaCanbedividedintotwocategories，aclassofhrpZpsgatrepresentatives，includinghrpZps912，othertothehrpZpsgs!，includingthehrpZgenesfromthestrainsofPsgr0andrace4．Thenucleotidehomologyofthesetwotypesshowed79％andtheproteinhomologyWas77％，whichcontainedabundantglycine(G)andLIHEKLGDNFGASA，buthadnocysteine(C)．However,itdidnotshowanysequenceidentitywiththoseofothergenusofgram-negativeplantpathogenicbacteria．Keywords：Pseudomonassyringaepv．glycinea；hrpZgene；prokaryoticexpression 丁香假单胞大豆致病变种细，z基因的克隆及编码蛋白的纯化与功能研究革兰氏阴性植物病原细菌可以在非寄主植物和抗病植物上激发过敏反应(hypersensitiveresponse，liP．)，在感病寄主上具有致病性(pathogenicity)。这一特性由细菌中hrp基因簇决定(Lindgrenetal．，1986)。hrp基因簇的特定基因编码产物harpin是一类可以在非寄主植物上激发HR的非特异性蛋白质激发子，是目前研究得较为深入的一类细菌分泌蛋白。(Weieta1．，1992)首次从梨火疫(Erwiniaamylovora)中分离得到一种能引起过敏反应的蛋白激发子mpN，随后harpin在所有常见的革兰氏阴性植物病原细菌中相继被发现，但不同来源的harpin类蛋白在植物上的作用位点以及关键功能域方面还是存在一定差异。大豆细菌性斑点病是我国尤其是北方大豆产区的一种重要病害，给农业生产带来巨大损失，其病原物为丁香假单胞大豆致病变种(Pseudomonassyringaepv．glycinea)是世界范围内重要的植物病原细菌。本实验室前期从北方大豆产区分离和鉴定了7株大豆细菌性斑点病菌，并对该病原菌的ⅡI型效应分子进行了研究(张金梅等，2011)。目前，对于大豆细菌性斑点病菌harpin蛋白编码基因hrpZ的功能研究甚少，国外只在Race4(Prestoneta1．，1995)和Psgr0(Inoueetal．，2006)菌株中克隆和表达harpin蛋白。国内(姜兆远等，2009)克隆并表达来Psgl2菌株中的harpin蛋白，与国外报道的hrpZ基因同源性为79％。由此，我们推测来自丁香假单胞大豆致病变种harpin编码基因可能存在多样性。本文依据已登录的大豆细菌性斑点病菌hrpZ基因序列设计引物，从本实验室分离鉴定的Al和S1菌株中克隆到hrpZ基因，并对其编码产物进行了表达、纯化及功能研究。本研究旨在丰富世界范围内的Psyringae的hrpZ基因资源，为研究假单胞菌harpin类蛋白的结构和功能关系提供基础，同时，为新型微生物蛋白农药的研发及转基因抗病育种提供基因资源。1材料和方法1．1菌株和质粒本研究所用的菌株和质粒见表1．1表1-1本研究所用质粒和菌株Table1-1ListofbacterialtrainsandplasmidsusedinthisstudyStrainsPseudomonassyringaepv．glycineaAIPseudomonassyringaepv．glycineaS1WildtypeWildtypeStoredinthislabStoredinthislab 研究内容第一章丁香假单胞大豆致病变种harpin编码基因的克隆与表达Escb舸ichiacoliDH5aEscherichiacoliBL21(DE3)PlasmidspMDl8-TpET4Ia(+)r080山缸Z△M12minirecAF-ompThsdS20(rb-mb-)galpUCori，cloningvector，Ap'pBR322origin，FIorigin，lacl,His-Tag，GST-Tag，S-Tag，Km。StoredinthisIabStoredinthislab瑚CaraChen’slab1．2主要试剂本研究所使用的pMDl8．T、T4连接酶和限制性内切酶(TaKara公司)；质粒提取试剂盒和回收纯化试剂盒(Axygen公司)；异丙基p．硫代半乳糖苷(IPTG)、蛋白酶K(ProteaseK)、蛋白酶抑制剂苯甲基黄酰氟(phenylmethylsulfonylfluoride，PMSF)、Triton-X．100(北京索莱宝科技有限公司)。1．3培养基、抗生素和培养条件本研究所使用的培养基如下：1．LB培养基ContentConcentration(g／1)TryptoneYeastExtractNaCl10．O10．05．O加入900ml去离子水搅拌至完全溶解，用NaOH调PH值至7．0．7．2，定容到1000ml。分装后121"C高压灭菌20min。LA培养基：每1000mlLB液体中加入159琼脂。2．KB培养基ContentConcentration(g／1)Tryptone甘油K2HP04MgS04’7H2020．O10．O1．5加入900ml去离子水搅拌至完全溶解，调PH值至7．2，定容到1000ml。分装后121"(2高压灭菌20min。KA培养基：每1000mlKB液体中加入159琼脂。 丁香假单胞大豆致病变种切’z基因的克隆及编码蛋白的纯化与功能研究试验中使用的质粒均保存在大肠杆菌DH5a中。大豆细菌性斑点病菌(Pseudomonassyringaepv．glycinea)A1和S1于KB培养基中28"C振荡培养或固体平板培养48h，EscherichiacoliDH5a和BL21于LB培养基中37"C培养。抗生素卡那霉素(Km)使用终浓度为50I．tg／ml。1．4缓冲液1．磷酸缓冲液(PBS)ContentConcentration(g／1)NaCl8．OKClN棚04K2HP040．21．420．27加入约900ml去离子水搅拌至完全溶解，调PH值至7．3，将溶液定容到1000ml后，室温保存。2．1．5MTris‘HCl(PH8．8)称取181．79Tris，加入约900ml去离子水搅拌至完全溶解，值至8．8，将溶液定容到1000ml后，室温保存。3．1M"Iris·HCl(PH6．8)称取121．1gTris，加入约900ml去离子水搅拌至完全溶解，值至6．8，将溶液定容到1000ml后，室温保存。4．30％Aerylamide然后用浓HCI调PH然后用浓HCl调PHContentConeentration(g／1)丙烯酰胺(Acrylamide)290．0N,N'-亚甲基双丙烯酰胺10．0加入约900ml去离子水搅拌至完全溶解，将溶液定容到1000ml，用0．451un滤器滤去杂质于棕色瓶中保存。5．10％(W／V)SDS称取109高纯度的SDS，加入约90ml去离子水，68℃加热溶解，然后用浓HCl调PH值至7．2，将溶液定容到100ml后，室温保存。6．1O％(W厂V)过硫酸铵 研究内容第一章丁香假单胞大豆致病变种harpin编码基因的克隆与表达称取lg过硫酸铵，加入10ml的去离子水后搅拌溶解，贮存于4℃。10％过硫酸铵溶液在4"C保存可以使用2周左右，超过期限会失去催化作用。7．5xSDS．PAGE电极缓冲液ContentConcentration(酣)瞄SGlycineSDS15．194．05．O加入约900ral去离子水搅拌至完全溶解，将溶液定容到1000ml后，室温保存。8．考马斯亮蓝R-250染色液称取lg考马斯亮蓝R-250，加入250ml异丙醇和100ml冰醋酸搅拌至完全溶解，将溶液定容到1000ml后，用滤纸去除颗粒物质后，室温保存。9．考马斯亮蓝染色脱色液加入100ml冰醋酸和50ml乙醇搅拌至完全溶解，将溶液定容到1000ml，充分混合后使用。10．50×TAE缓冲液ContentConcentration(g／1)砸SNa2EDTA·2H20242．037．2加入约800ral去离子水搅拌至完全溶解，加入57．1ml冰醋酸，充分搅拌，将溶液定容到1000ml后，室温保存。1．5大豆细菌性斑点病菌基因组DNA的提取1．大豆细菌性斑点病菌(Pseudomonassyringaepv．glycinea)A1和Sl于KB固体培养基上培养48h后，用牙签挑取单菌落，接种于25mlKB液体培养基中，28℃，200rpm振荡培养48h。2．收集培养好的菌液分装到2mlEP管中，12000rpm离心2min，弃上清。3．每个EP管中加入7001上I碱裂解液，充分涡旋，37。C放置20．30min。4．向菌体裂解液液中加入50山SDS，4山蛋白酶K，上下翻转混匀，70℃放置20min。5．每个EP管中加入7001al苯酚，振荡摇匀，12000rpm／min，4X2离心10min。小 丁香假单胞大豆致病变种hrpz基因的克隆及编码蛋白的纯化与功能研究心吸取上清，转移到新的EP管中。6．向上清中加入5mRNAase，37℃静置15．20min。7．加入等体积的氯仿．异戊醇混合液(体积比为24：I)，振荡摇匀，12000rpm／min，4℃离心10min。小心吸取上清，转移到新的EP管中。8．将上述上清液重新用氯仿．异戊醇抽提一次(如果上一步已经将蛋白抽提干净，此步骤可以省略)。9．向上清液中加入2倍体积的冰乙醇，4"12放置较长时间。lO．待观察有白色絮状物沉淀出现时，用毛细玻璃棒轻轻挑出DNA，用70％乙醇漂洗1次，将DNA溶于looI_tl灭菌水或TE中，．20℃保存使用。基因组DNA提取后，以1．0％琼脂糖凝胶电泳检测所提DNA的质量。具体操作如下：(1)在盛有一定量的lxTAE的三角瓶中，按照1．0％加入准确称量的琼脂糖，在微波炉中加热至琼脂糖完全熔解。(2)待溶液冷却至约60℃后，按5I_tL／100ml溶液加入DNA染色剂EB(Ethidiumbromide，溴化乙锭)溶液，混匀。(3)将上述配制溶液倒入胶槽中，放置好梳子，液面接近每个齿的跟部，但不要接触到齿跟。检查梳子的齿下，或齿间是否有气泡。如有气泡，可用枪头除去。(4)凝胶溶液完全凝固后，小心移去梳子。将凝胶放入电泳槽中，加入足够的lxTAE，使其浸过胶面lmm。(5)将基因组DNA溶液5pL与含有溴酚蓝指示剂的loadingbuffer(6×)1J，tL混合，使用微量移液器将其加至点样孔中。(6)接通电源，将电压调至100V。电泳至指示条带(溴酚蓝)在凝胶中迁移出适当的距离。(7)切断电源，取出凝胶，在紫外凝胶成像仪中进行观察和拍照。(8)用分光光度计测定基因组DNA浓度及纯度。保存于．20"12下备用。1．6引物的设计与合成依据Genbank中登录号为L41862的hrpZ序列，设计完整开放阅读框(ORF)弓物，在5’端分别引入BamHl和EcoRl酶切位点(下划线标出)。引物序列：P1：5’·GGQ她￡￡ATGCAGAGTCTCAGTCTlrAACP2-5’-GG!!鱼型匹!￡TCAGGCAGCAGCCTGGTl’G。引物的合成由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。 研究内容第一章丁香假单胞大豆致病变种harpin编码基因的克隆与表达1．7hrpZ基因的扩增以大豆细菌性斑点病病原菌(Pseudomonassyringaepv．glycinea)的基因组DNA为模板进行PCR扩增。反应体系及PCR扩增程序如下：10×rTaqBuffer2．5mdNTPMixture(2．5mmol／m1)1．5山MgCl2(2．5mmol／m1)2．O“lrTaq(5u／“1)O．25mupstreamprimer(20pmol／m1)0．5山downtreamprimer(20pmol／m1)0．5山DNAtemplate1．O山Steriledeionizedwaterupto25mPCR扩增程序：94。C预变性4min；94。C变性lmin；56℃退火lmin；72℃延伸90s；循环35次；72"C延伸10min。1．8PCR产物的纯化按前述方法进行1．0％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，确定得到目的条带，然后使用胶回收试剂盒进行切胶回收。具体操作步骤如下：1．制备较大的加样孔(约100mL)的1．0％琼脂糖凝胶，电泳PCR产物。2．在紫外光下切取目的条带处的胶块，用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎。计算凝胶重量，该重量作为一个凝胶体积(如lOOmg=lOOpg体积)。3．加入3个凝胶体积的BufferDE．A，混合均匀后于75℃加热至凝胶块完全熔化。4．加入0．5个BufferDE．A体积的BufferDE-B，混合均匀。5．吸取步骤(4)中的混合液，转到DNA制备管中，12000rpm离心lmin，弃滤液。6．将制备管置回2ml离心管，加入500山BufferW1，12000rpm离心30s，弃滤液。7．将制备管置回2ml离心管，加入700山BufferW2，12000rpm离心30s，弃滤液。以同样的方法再用7001上1BufferW2洗涤一次，12000rpm离心lmin。8．将制备管置回2ml离心管，12000rpm离心lmin。9．将制备管置于洁净的1．5ml离心管中，在制备膜中央加入25．30山灭菌水，室温静止lmin。12000rpm离心1min洗脱DNA。 丁香假单胞大豆致病变种纫亿基因的克隆及编码蛋白的纯化与功能研究1．9PCR产物与pMDl8-T载体连接连接反应体系如下：pMD-18-T载体目的片段Solution10．5m2．01al5．0rtlUpto10山Steriledeionizedwater连接反应溶液于16℃下保温12h。1．1lO大肠杆菌感受态的制备具体操作步骤如下：1．吸取100ul在．20℃保存的DH5a甘油涂布于LB培养基平板上，37℃培养24-48h，然后挑取已活化菌落在LB培养基平板上划线稀释，37℃培养过夜。2．挑取DH5a单菌落移至20mlLB液体培养基中，37。C，180rpm，振荡培养过夜(12．18h)。3．吸取上述培养液O．5ml再移至50mlLB液体培养基中，相同条件下继续振荡培养2．3h，至OD600=0．2．0．4。4．将菌液转移到50ml离心管中，冰上放置10min。5．4000rpm／min，4"C离心10min，收集茵体细胞。6．用10ml冰预冷的O．1MCaCl2悬浮菌体，置于冰上30rain。7．重复步骤(5)。8．用2m1冰预冷的0．1MCaCl2悬浮菌体，加入60％的甘油(终浓度为15％)。9．分装感受态细胞，每200p1为一份。1．11连接产物的转化具体操作步骤如下：1．取1管感受态细胞溶液加入10I_tl连接反应溶液于1．5mlEP管中，轻轻混匀，冰上放置30min。2．42℃热激90s，不要摇动。3．快速将转移到冰上，放置5min。4．每管中加入8001JILB液体培养基后，37。C振荡培养O．5．1h。5．浓缩上述培养液至50．09L。 研究内容第一章丁香假单胞大豆致病变种harpin编码基因的克隆与表达6．5000-5500rpm／min，离心lmin，弃去上清。7．将剩余1009l已转化的感受态细胞均匀涂到含氨苄青霉(1001ag／m1)选择抗性LB平板上。倒置培养皿于37‘C培养12．16h。挑取乳白色单菌落，划线于抗性平板上培养。初步确定为阳性克隆，提取质粒进行酶切和PCR验证。1．12质粒的提取使用Axygen公司质粒DNA试剂盒提取初筛具有卡那霉素抗性的阳性克隆质粒。具体操作步骤如下：1．将筛选出的阳性克隆转移至20mlAmpl00的液体LB中，37℃(200rpm／min)振荡培养过夜。2．将4ml收集培养好的菌液分装到2mlEP管中，12000rpm离心lrnin，弃上清。3．加入250plBufferS1悬浮细菌沉淀，悬浮均匀，不应留有小的菌块。4．加入2509lBufferS2，温和并充分地上下翻转4．6次混合均匀使菌体充分裂解，直至形成透明的溶液。此步骤不宜超过5min。5．加入350}tlBufferS3，温和并充分地上下翻转6．8次，12000rpm离心10min。6．吸取步骤5中的离心上清，转移到制备管，12000rpm离心lmin，弃上清。7．将制备管置回离心管，加入500I．tlBufferW1，12000rpm离心lmin，弃滤液。8．将制备管置回离心管，加入700山BufferW2，12000rpm离心lmin，弃滤液。以同样的方法再用7001xlBufferW2洗涤一次，弃滤液。9．将制备管置回2ml离心管中，12000rpm离心1min。10．将制备管移入新的1．5ml离心管中，向制备管膜中央加入509l去灭菌水，室温静止lmin。12000rpm离心lmin。1．13质粒酶切及PCR验证209l酶切反应体系各组份如下：10xKBUfferPlasmidDNA髓DRl(15U／uL)BamHl(15U／laL)2．Owl耋1腭1．0wlI．Cl山SteriledeionizedwaterUpto20山376C酶切2．3h，按前述方法进行琼脂糖凝胶电泳。得到目的条带的克隆被初步确 丁香假单胞大豆致病变种纫’z基因的克隆及编码蛋白的纯化与功能研究为阳性克隆。将阳性克隆质粒送到南京金斯瑞生物科技有限公司测序，将阳性克隆菌株分别命为DH50JpMDl8一T-hrpZe，gAl和DH5a／pMDl8-T-hrpZesgsJ。1．14hrpZ的生物信息学分析序列同源性比对在GenBank(http：／／www．ncbi．nlm．gov)中通过Blast程序进行比对。采用DNAStar软件对hrpZe。gm和hrpZpsgsl的基因序列进行分析。1．15harpin融合表达载体的构建按前述方法分别提取DH5a／pMDl8-T-hrpZv聊l、DH5a／pMDl8-T-hrpZp。gsl和DH5tt／pET41ap)质粒DNA，并进行EcoRl和BamHl双酶切。回收得到的目的基因小片段分别与pET41a(+)大片段进行连接，然后转化大肠杆菌BL21感受态细胞(制备方法同前)。得到的重组菌株进行质粒提取、酶切验证和测序，并将它们分别命为BL21／pET41“+)-hrpZl,sgal和BL21／pET41a(+)-hrpZe。sst。1．16harpin融合蛋白表达的影响因素1．16．1不同浓度IPTG对harpin融合蛋白表达的影响将重组菌株BL21／pET41a(+)．hrpZ?se—l和BL21／pET41a(+)．hrpZ?sgsl分别接种于20mlkm50的液体LB中，37。C震荡培养过夜。次日按照1％的比例转接到kin50的液体LB中，37"C震荡培养至OD600为0．6—0．8，加入终浓度分别为0，O．01，O．03，0．05，O．1，O．2，O．5，0．7，1．0和2mM的IPTG，37"(2继续培养3h。同时以BL21和BL21／pET41a(+)为对照。1．16．2不同诱导温度对harpin融合蛋白表达的影响在加入终浓度为O．1mM的IPTG后，诱导温度分别设为28℃和37℃。其余与1．16．1相同。收集1．16．1和1．16．2处理的茵体，8000rpm／min，4"C离心10min，收集菌体，用PBS(磷酸缓冲液)洗三次，重溶于1／20原菌体培养体积的磷酸缓冲液中，向茵体悬浮液中加入终浓度为lOOpg／ml的溶茵酶，终浓度为0．1mM的蛋白酶抑制剂PMSF。超声波破碎细胞直至溶液半透明，12000rpm／min，4℃离心5min，分别保留上清液体和沉淀样品以备SDS-PAGE分析。32 研究内容第一章丁香假单胞大豆致病变种harpin编码基因的克隆与表达1．17SDS．PAGE凝胶电泳检测1．取样品20ul与5ul的5xSDS．PAGE上样缓冲液混合均匀，沸水浴10min。2．聚丙烯酰胺凝胶的配制如下：12％的分离胶(15ml体系)30％丙烯酰胺1．5MTris．HCl(PH8．8)10％SDSlO％过硫酸铵T：眦D去离子水6．0ml3．8ml150．Owl6．6：山4．9ml5％的浓缩胶(8ml体系)30％丙烯酰胺1．0MTris-HCl(PH6．8)10％SDS10％过硫酸铵卫陇D去离子水1．3ml1．0mi80．Om80．O山8．0IItl5．5ml3．聚丙烯酰胺胶的灌制及蛋白SDS．PAGE电泳，按以下程序进行：(1)安装好垂直电泳板，小心灌入分离胶，给浓缩胶留出足够的空间(约为梳齿以下lcm)，然后用酒精封顶。(2)37℃聚合约30rain后，用去离子水冲顶部数次，尽可能排去凝胶上的液体。(3)将浓缩胶溶液直接灌至聚合好的分离胶上，立即在其中插入一块干净的梳子，注意不要混入气泡，然后再加入一些浓缩胶溶液彻底填满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下。(4)37"C聚合约10min后，小心拔下梳子，用去离子水洗涤加样槽，以除去聚合的丙烯酰胺。(5)将玻璃胶板放至垂直电泳槽中，加入SDS—PAGE电极缓冲液。(6)每一加样孔中加入20ul样品并在一加样孔中加入蛋白Marker。(7)接通电泳仪，，开始电泳，恒流30mAH，电压100V，待样品进入分离胶呈一条直线后，调至恒压100V，电流80．90mAH继续电泳至溴酚蓝到达底部。(8)电泳完毕后，将凝胶置染色液中，室温染色3h后，将凝胶置脱色液中，室温 研究内容第一章丁香假单胞大豆致病变种harpin编码基因的克隆与表达lIl-MI、12lAB图1．2表达载体的PCIt和酶切分析Fig．1·2PCRandrestrictionanalysisofpET41a(+)-hrpZ削landpET41a(+)-hrpZ脚slA．PCRanalysisofrecombinantplasmidpET41a(+)-纫砀喇，andpET41a(+)-hrpZp够1．MDNAmarkerDL2000；1．hrpZe蹲,Ai；2．hrpZe蹲m；3．DDW．B．restrictionanalysisofrecombinantplasmidpET41a(+)-hrpZp,州andpET41a(+)-hrpZe，,sm．M1．x·HindIIIDNAmarker；M2．DNAmarkerDL20000；1．pET41a(+)-hrpZe酬；2．pET41a(+)-hrpZp罐sl2．2hrpZ的生物信息学分析重组质粒pET41a(+)-h179ZpsgM序列测定结果显示，hrpZese,A1基因大小为1026bp，编码341个氨基酸，其编码的蛋白质富含甘氨酸(13．19％)，不含半胱氨酸；重组质粒pET41a(+)一hrpZe。gsl序列测定结果显示，hrpZpsg,sl基因大小为1038bp，编码345个氨基酸，其编码的蛋白质富含甘氨酸(12．75％)，不含半胱氨酸。GenBank数据库中相似性搜索比较显示，hrpZesgSl与国外以报道的Psgr0和Race4菌株的hrpZ相似性为99％，与国内以报道的Ps912菌株的hrpZ相似性为79％；hrpZvsg_l与国内以报道的Psgl2菌的hrpZ相似性为99％，与国外以报道的Psgr0和Race4菌株的hrpZ相似性为79％。氨基酸比对发现harpinZpsgAl蛋白与harpinZpsgsl在213-275位氨基酸均存在两个G．G．G．L．G重复序列，200．300位氨基酸是甘氨酸富集区域，推测与在非寄主植物上激发过敏相关(图1．3)。此外，harpinZpsgsl和harpinZpssAl在第28--41位氨基酸存在harpin家族第三组群特征序列，LIHEKLGDNFGASA序列。harpingpsgsl和harpinZpsgAI与mpz超家族相似性为32％99％(表1—2)，此结果也符合harpin在不同属间相似性低而在同一个属下不同致病变种间相似性较高的特点。 丁香假单胞大豆致病变种^档基因的克隆及编码蛋白的纯化与功能研究表1-2大豆细菌性斑点病菌^Ⅲ‰f基因及其编码产物harpin蛋白的同源性比较Table1-2ThehomologyofhrpZen．slgeneandharpinproteinofPseudomonassyringaepv．glyclneacomparedwithotherplantPseudomonassytingaepathogens‘Psg,月缈'ingaepv．glycinea；Pph,Psyringaepv．phaseolicola；Pss，只掣ringaepv．s2yringae；Ps乞只蜊ngaepv．tomato；Pc，Pseudomonascichorii；Pv'Pseudomonasviridiflava；Ea,F．rw加缸amylovora；‘AccessionnumberofGeneIDinGenBank．36 丁香假单胞大豆致病变种_jlrpz基因的克隆及编码蛋白的纯化与功能研究图1_4不同浓度的IPTG诱导融合蛋白harpinZv难sl的表达情况Fig．1-4harpinZv碓slproteinwasinducedinthepresenceofIPTGatdifferentconcentrationM．ProteinMarker；,1．BL21；2．BL2l／pET41a(+)；theIPTGconcentrationof3，4’5，6，7，8，9and10werc0，0．01，0．05，0．1，0．2。0．5，O．7，1．0and2．0mM,respectively融合蛋白harpinZpsgAl和harpinZpsgsl在37。C乘I28℃诱导表达情况不尽相同。37。C条件下两者都很好地被诱导表达，在超声波破碎后的上清和沉淀中均发现一条62kDa大小的蛋白条带，harp试乙PsgAl和harpinZpsgsl分子量大小约为35kDa，GST标签蛋白大小约为27kDa。28℃条件下harpir亿psgAl和harpinZp蹭Sl蛋白则以不可溶形式(包涵体)存在，即主要存在于超声波破碎后的沉淀中(图1-5)。图1．5SDS-PAGE检测37℃和28℃下harpm融合蛋白表达情况Fig．1．5SDS-PAGEdetectionoftheharpinproteinexpressedinBL21harboringareconstructedplasmidpET41a(+)-hrpZe,馨mandpET41a(+)mrpZ脚siat37℃and28℃A．BL21／pET41a(+)-hrpZ，,uJandBL21／pET41a(+)-hrpZe，zslexpressedat37"C．M．ProteinMarker；,1．BL21；2．BL2l／pET41a(+)；3and4．sonicatedcellsupematant；5and6．sonicatedcelldeposit；3and5．BL21，pEl’4l斫哆切喝№^，；4and6BL21，pl玎4．1计)．铆场捌B．BL2I／pET41a(+)-hrpZe倒sandBL21／pET41a(+)-hrpZe镏ssexpressedat28"C·M．ProteinMarker；,1．BL21；2．BL21／pET41a(+)；3and4．sonicatedcellsupcrnatant；5and6．sonicatedcelldeposit；3and5．BL21／pET41a(+)-hrpZp路．A；；4and6．BL21／pET41a(+)-hrpZeh．．sl3讨论本文从东北大豆细菌性斑点病菌两个菌株Al和Sl中分别克隆了harpin蛋白编码基因hrpZes鲥J和hrpZesgs．，(GenBank序列号：HM358042、HM358043)。其核苷酸数目为1026bp和1038bp；甘氨酸含量为13．19％养ffl12．75％，不含半胱氨酸；具有保守 研究内容第一章丁香假单胞大豆致病变种harpin编码基因的克隆与表达的功能序列LmEKLGDNFGASA。这些结果均证明hrpZp,gAl和hrpZp,gsj的编码产物就是harpin家族成员，并且属于第三组群，假单胞菌组群。通过生物信息学分析，我们发现来自丁香假单胞菌大豆致病变种hrpZ基因可分为两类，一类以hrpZese叫t为代表，包括hrpZe，912，另一类以hrpZpsgsl为代表，包括来自Psgr0和Race4菌株的hrpZ基因。这两类hrpZ基因的核苷酸同源性为79％，氨基酸同源性为77％。说明东北大豆细菌性斑点病菌的harpin蛋白编码基因确实存在遗传多样性，由此，我们推测东北地区的大豆细菌性斑点病菌可能也具有遗传多样性。在harpin蛋白诱导表达过程中，我们使用pET41a(+)表达菌株，GST融合表达harpin蛋白，主要是我们希望后期的蛋白纯化工作通过Hi曲．AffmityGSTResin来完成。pET41a(+)本身带有GST标签，既可以提高外源蛋白的可溶性，有利于蛋白保持原有活性，又便于后续纯化。但GST标签极易受外界条件影响而脱落，如超声波破碎条件等。因此，本实验在蛋白提取的过程采用更为温和的破碎方式，加入溶菌酶，蛋白酶抑制剂PMSF及Triton-X．100，同时降低超声波破碎功率等。粗提蛋白harpinZpsgsl经High-AffinityGSTResin纯化后虽仍可见降解的标签蛋白，但蛋白降解情况明显改善。 第二章harpinZPS2s1蛋白的纯化及生物活性检测摘要：为了了解harpinZpsgsl蛋白的特性，本研究通过GST融合基因系统对harpinZp蹭s1蛋白进行了表达和纯化。结果显示，纯化的harpirlZpsgsl可以在非寄主植物烟草上激发过敏反应，并且过敏反应可以被真核生物代谢抑制剂所抑制。1001』g／ml的纯化harpinZvsgsl经100'C沸水浴处理10rain，仍可在烟草上激发HR，但经蛋白酶K处理后，则丧失在烟草上激发HR．的能力，表明大豆细菌性斑点病菌harpinZpsssl对热稳定，对蛋白酶K敏感。关键词：harpinZPsgSl蛋白；纯化；烟草；过敏性反应BIOLOGICALACTIVITYDETERMn咖IONANDPURjFICATIONOFHARPINZPsgS1Abstract：InordertounderstandthechemicalcharacteristicsofthegeneproductsencodedbyhrpZw鲥landhrpZejgSl。weexpressedharpinZvsgAlandharpinZpsgslinE．coliexpressionsystemandpurifiedharpinZpsgslthroughHi曲-AffinityGSTResin．ThepurifiedharpinZp蹭slwaLsheat-stable，sensitivetoproteaseK，andalsocouldtriggerHRintobaccoasotherknownharpins．Besides，theHRelicitationoftheproteinintobaccowasdispelledbyeukayoticmetabolicinhibitors．Keywords：harpinZpsgslprotein；purification；tobacco；hypersensitiveresponseHarpin蛋白是一类植物病原细菌产生的可以在非寄主植物上激发过敏反应的非特异性蛋白质激发子。其共同特征是：富含甘氨酸、不含半胱氨酸，对热稳定，对蛋白酶K敏感，可以在非寄主植物烟草上激发过敏反应，过敏反应可以被真核生物代谢抑制剂抑制。体外表达的harpin蛋白能够诱导植物产生多种有益表型，包括诱导植物抗病、抗虫及促进植物生长等，但harpin蛋白在植物与病原细菌互作过程中的作用位点及功能域方面还存在一定差异。GST融合基因系统是一种简单、快速表达和纯化蛋白的技术(Fangetal，2004)。利用这种技术不需要大型、贵重仪器，操作步骤简单，在两条天时间内即可得到大量的纯化蛋白。为了了解harpinZesgsl蛋白的harpin蛋白特性，本研究通过GST融合基因系统对harpinZpsgsl蛋白进行了表达和纯化。结果显示，每升BL21／pET41a(+)-hrpZe。gsl发酵液经High-AtYmityGSTResin纯化，可提纯harpinZPsgSI蛋白约20mg，纯化后的harpinZp踞S1蛋白表现出了harpin蛋白的共同特征。初步判断harpinZpsgSI蛋白就是丁香假单胞大豆致病变种(Pseudomonassyringaepv．glycinea)41 丁香假单胞大豆致病变种h,7,z基因的克隆及编码蛋白的纯化与功能研究Sl菌株的harpin蛋白。1材料和方法1．1菌株本研究所用的菌株见表2．1。表2-1本研究所用菌株Table2-1Listofbacterialstrainsusedinthisstudy1．2主要试剂氯化镧(Lanthanumchloride，LaCls)、钒酸钠(Na3V04)、环己酰亚胺(cycloheximide)(阿拉丁)、BCA蛋白浓度测定试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司)、GST纯化填料(High．AffinityGSTResin)购自南京金斯瑞生物科技有限公司。还原型谷胱甘肽(GSH)购自北京索莱宝科技有限公司。1．3培养基、抗生素和培养条件见第一章。1．4缓冲液1．磷酸缓冲液(PBS)：参见第一章。2．SDS．PAGE蛋白电泳缓冲液：参见第一章。3．染色液：参见第一章。4．脱色液：参见第一章。5．10％过硫酸铵与10％SDS：参见第一章。 6．1xGSTBind／WashBuffer(PBS)缓冲液ContentConcentration(卯)NaClKClNa2HP04K2I-IP048．18O．21．420．24加入约900ml去离子水搅拌至完全溶解，调PH值至7-3，将溶液定容到l000ml后，室温保存。7．10xGSTElutionBuffer(100mM还原型谷胱甘肽)称取6．19Tris．HCl、3．19还原型谷胱甘肽，加入约90ml的去离子水后搅拌溶解，PH调至8．0将溶液定容到100ml后，分装存放于．20℃保存，以免谷胱甘肽被氧化。10xGSTElutionBuffer在一20"C下可以稳定6个月，耐受5次以下的冻融。每次使用前用去离子水将10xGSTElutionBuffer稀释成l×。1．5harpinZr罐sl蛋白的纯化harpinZPsssl蛋白的纯化和纯化柱的平衡均按照操作说明书上进行。具体操作步骤如下：1．轻柔、充分翻转摇匀树脂悬浊液。用宽嘴吸头吸取所需要的树脂浆(其中树脂为50％)。为了避免出现气泡，往柱子中添加树脂时将吸头尖端始终置于柱子液面以下。lOml的重力平衡柱最多可以加载5ml树脂(柱床体积)，至少可以纯化30mg的目的蛋白2．等待树脂沉降后放出储存缓冲液(20％乙醇)，待储存缓冲液面降到柱床上沿以下时，用10倍体体积的lxGSTBind／WashBuffer洗树脂，并用玻璃棒将树脂悬浮起来，竖直置于4℃冰箱中3．等待树脂沉降后放出lxGSTBind／WashBuffer洗树脂，待液面降到柱床上沿以下时，加入制各好的粗提蛋白液。并用玻璃棒将树脂悬浮起来，竖直置于4"C冰箱中沉降2．3h。使标签蛋白与树脂充分结合。4．等待树脂沉降后放出穿过组分，将流速控制在每小时lO倍柱体积为宜。如果流速过快，洗脱的目的蛋白中会混入较多的杂质。收集穿过组分并置于冰上。5．以20倍体积l×GSTBin扪№shBuffer洗柱，收集穿过组分并置于冰上。6．以10．15倍体积lxGSTHutionBuffer洗脱目的蛋白。收集洗脱组分置于冰上43 丁香假单胞大豆致病变种hrpZ基因的克隆及编码蛋白的纯化与功能研究待后续分析。7．分析洗脱和穿过组分中出现的目的蛋白。若目的蛋白是无功能的GST则无法与树脂结合、纯化。1．6树脂的再生与储存High．AffinityGSTResin至少可以重复使用三次而无需再生。但随着非特异性结合的蛋白的增多和蛋白的聚集，往往会造成流速和结合载量都下降。为了去除结合在树脂上的蛋白可用2倍体积的0．1M"IrisHCl，0．5MNaC!，PH8．5洗树脂，接着用2倍体积的O．1M醋酸钠，0．5MNaCI，PH4．5再洗一次。其它可用做去除污染蛋白的缓冲液还包括：6M尿素，6M盐酸胍或低级性溶剂，如50．70％乙醇或50％乙二醇。任何上述处理后应立即用3．5倍体积I×GSTBind／WashBuffer平衡。树脂可以在4℃，20％乙醇或80％水中长时间存放。1．7harpinZp。。s1蛋白的脱盐和浓缩使用Millipore公司的截留分子量为30kDa的离心超滤管对纯化的harpinZl,sgsl进行脱盐和浓缩。离心超滤管使用前用灭菌水彻底清洗，按比例加入待浓缩的样品溶液和灭菌水，为彻底脱盐和去除可溶小分子杂质，可将待测浓缩样品稀释到离心超滤管最大容积再离心。按照超滤离心管指示离心速度和时间离心。通过离心力，使溶液中分子量小于30kDa的小分子溶液和溶剂透过超滤膜，被收集在滤过液收集瓶中，而分子量大于30kDa的大分子溶质则被超滤膜截留在样品浓缩管中。为了得到最高的收率，所选滤膜的截留分子量建议选择所需截留分子大小的1／3左右，不超过目标分子量的一半。最后回收浓缩管中截留的蛋白样品。1．8纯化harpinZp。gSl蛋白的浓度测定纯化harpinZp瞄l蛋白浓度的测定按照BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书进行。具体步骤如下：1．取0．8ml蛋白标准配置液加到一管蛋白标准(20mgBSA)中，充分溶解后配制成25mg／ml蛋白标准溶液。配制后可立即使用，也可以．20℃长期保存。2．取适量25mg／ml蛋白标准，用灭菌水稀释至终浓度为0．5mg／ml。3．根据样品数量，按50体积BCA试剂A加l体积BCA试剂B(50：1)配制适量的BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24h内稳定。 4．将标准品按0，1，2，4，8，12，16，20山加到1．5ml的灭菌离心管中，加灭菌水补足到209l。每个测定要做3个平行反应。5．各管中加入200I．tlBCA工作液，37"C放置20．30min。6．测定A562，OD值的测定要在lh内完成。7．绘制标准曲线，查出未知样品的浓度。1．9harpinZi'sgSl蛋白的鉴定1．9．1harpinZpsg,sI激发烟草产生HR最小浓度取纯化的harpinZpsgsl蛋白(ge度为lmg／m1)，用灭菌水稀释成1．0，0．7，0．5，0．3，0．2，O．1，O．7x10～，O．5x10"1mg／ml，8个处理分别注射到烟草叶片中，观察HR最小激发浓度。同时取harpinxo∞纯化蛋白液，用灭菌水稀释成1．0，0．7，0．5，0．2，O．1，0．7x10～，0．5x10"1，O．1x10～mg／ml，注射烟草作为HR激发的阳性对照，设灭菌水为阴性对照。1．9．2harpinZpsgsl蛋白的生化特征纯化的harpinZp蹭SI(浓度为1001xg／m1)分成5份，每份loopl，进行如下处理：(1)100℃沸水浴10min：(2)加入蛋白酶K(终浓度2099／m1)，37℃温育15min；(3)加入氯化镧(终浓度2x10。3moUL)；(4)加入钒酸钠(终浓度5x10"5m01]L)；(5)加入环己酰亚胺(终浓度l×10’4mol／L)。5个处理分别注射到烟草叶片中，36h内观察接种区域的HR表型，同时以未处理的harpinZp。gsI和清水为对照。2结果与分析2．1harpinZ哑sl蛋白的纯化利用High-AffinityGSTResin对harpinZp。gSl蛋白进行纯化，harpinZp蹭Si的GST标签可以和树脂材料特异性地结合，从而被洗脱下来。使用IxGSTBind／WashBuffer洗脱杂蛋白，收集穿过组分电泳检测(图2．1，泳道4，5)，使用10mMGSTElutionBuffer(还原型谷胱甘肽)洗脱标签蛋白，电泳结果显示在分子量为62kDa处有单一条带，即为融合蛋白(图2-1，泳道6)，纯蛋白经超滤离心管脱盐浓缩后，使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定浓度。45 2．3harpinZp。gsl蛋白的鉴定重组菌株BL21／pET41a(+)-hrpZv蹭sl诱导表达后提取的harpirlZPsgSl蛋白经纯化后可在非寄主植物烟草上激发过敏反应，harpinZpsssl激发过敏反应的最小浓度为1001坞,／ml(图2．3，A)，低浓度的harpinZPsgsl虽不能激发肉眼可见的过敏反应，但可以激发micro．HR反应，显微镜下可以观察到坏死细胞被染成蓝色(图24)。纯化的harpinZp铭SI经100"C沸水浴处理10min，仍可在烟草上激发HR；harpinZpsgSl经蛋白酶K处理，则丧失在烟草上激发HR．的能力，表明大豆细菌性斑点病菌harpinZpsgSl对热稳定，对蛋白酶K敏感。harpinZp掣sl与氯化镧、钒酸钠、环己酰亚胺混合后注射烟草则丧失激发HR的能力，表明harpinZpsgSl蛋白激发FIR活性可以被真核生物代谢抑制剂所抑制(图2．3，B)。上述结果均表明harpinZp路s1与革兰氏阴性植物病原细菌中的产生的harpin具有相同的理化性质和生物学功能。B图2-3harpinZe吃sl最小激发腿浓度和其生化特性的测定Fig．2-3TheminimaproteinconcentrationofHReHcitingactivityanddeterminationofthebiologicalactivitiesofharpinZ嘣loRMXanthamianaA．1rhemi血naproteinconcentrationofharp‰!HRelicitingactivityonⅣXontham溉．B．PurifiedharpinZPI|sl(1001蟛m1)weremixedwidleulmryotesmetabolicprocessesinhibitors，orheat订朗led．orproteaseKuv．ated．1．harp‰,；2．sterilew砷犯3．Ilarpi‰lheat-treatment；4．harpinZPlgslproteaseKtrea劬eng5．harp‰1withLaCl3；6．1'mrpinZv罐slwithNa3V04；7．harpinT_懈1withcycloheximide47 丁香假单胞大豆致病变种铆，z基因的克隆及编码蛋白的纯化与功能研究harpinzp追j1DD、、’◆图2-4低浓度的harpin砀嚼1激发的micro-HR反应Fig．2-4ThelowconcentrationofharpinT_俩gstcamelicitmicro-HRon溉一曲朋l￡肼“3讨论High-AffinityGSTResin是用于纯化融合表达谷胱甘肽S转移酶(GST)的目的蛋白或天然GST或谷胱甘肽结合蛋白，操作方便快捷。High-AmrdtyGSTResin采用11个原子的间隔比，通过硫键共价结合还原型谷胱甘肽，提高纯化效率。纯化的harpin蛋白为进一步研究其结构和功能提供了更为有利的基础。同时，采用10raM的还原谷胱甘肽的温和洗脱，也使目的蛋白的活性受到了很好的保护。纯化的harpinZp。gsl经过热处理后仍能激发烟草HR反应，而经蛋白酶K共同孵育后或者与相关真核生物代谢抑制剂混合后则丧失在烟草上激发HR的能力。这均表明harpinZpsgs,具有harpin蛋白的共同特征。ha∞iI‰sl激发过敏反应的最小浓度为1001xg／ml，低浓度的harpil3Zpsgsl虽不能激发肉眼可见的过敏反应，但可以激发micro．HR反应。harpinZP瞄l具有harpin蛋白的特征，但还需要进一步实验来证明。如是否激发腿标志性基因hsr203J和hsr515在烟草体内的表达?是否可以促进植物生长?是否激活植物体内的防卫反应，诱导植物系统获得抗病性?此外，不同植物病原细菌产生的harpin虽然具有HR激发活性，但其在植物上的作用位点以及功能域还存在一定差异。因此harpinZp路sl在植物上的作用位点以及最小功能区域也将是我们下一步的研究重点。 第三章harpinZPSgsl蛋白诱导烟草系统获得抗性机理研究摘要；HR一直被认为是植物对病原物的一种抗性反应。纯化的harpinZp蹭S1蛋白能激发烟草产生HR。Real-timePCR结果显示harpinZpsgsl诱导烟草产生腿时能激活HR标志hsr515和hsr203J的表达，同时也能激活防卫反应相关基因朋唿J、GSTl、Pal和PR蛋白家族基因尸R．1a、Chia5的表达，但不能激活乙烯信号通路转录调控因子EIN2的表达。纯化的harpinZpsgsl处理烟草可以促进烟草的生长，显著提高烟草对TMV和疫霉的抗性，而且抗性不仅局限于harpinZvsgsl处理的叶片，也包括处理周边的叶片和整株植物。进一步说明harpinZvsgsl可以可诱导烟草产生一种可上下移动的信号，从处理部位移动到非处理部位并激活植物的基础防卫反应，诱导植物系统获得抗性，并且该抗性属于水杨酸诱导的SAR。关键词：HR；harpinZpszs!；烟草；系统获得抗性；Real—timePCRTHEMECHANISMOFHARPINZPsgS1INDUCEDTOBACC0SYSTEMICACOUIREDRESISlANCEAbstract：HRwasalwaysbeenconsideredasaresistantreactionoftheplantpathogens．ThepurifiedharpinZvsgslcanelicitHRontobacco．Real—timePCRresultsshowedthattheHRelicitedbyharpinZpsgslwasalongwiththeexpressionofHCDmarkedgeneshsr303jandhsr515，accompaniedexpressionbytheSAP,positiveregulatoryfactorNPRl，phytoalexinsynthesisrate-limitingenzymegenePal,PRproteinfamilygenePR—laandChia5，butdidnotdetecttheexpressionofethylenesignalregulatorytranscriptionfactorsEIN2．ExogenousharpinZpsgstCallpromotethegrowthoftobacco，significantlyincreasedtheresistanceoftobaccotoTMVandPhytophthora，alsotheresistanceisnotconfinedtothetreatedleaves。includingthesurroundingleavesandthewholeplants，furtherdefmedasystemicacquiredresistanceinducedbyharpinZpsgSiWasdependentonthesalicylicacidsignalingpathway．Keywords：HR；harpinZpsgslprotein；tobacco；SAR；Real-timePCR植物系统获得抗性(SAR)是指过敏反应发生后，植物获得的对病原菌的广谱抗性。系统获得抗性是植物防卫反应基因被系统诱导表达的结果，特别是病程相关蛋白(pathogenesis-related，PR)基因。harpin的一个重要特征就是可以激发非寄主植物的过敏反应，进而启动植物的基本防卫机制，诱导植物的SAR。以往研究表明，外施harpin蛋白可以诱导植物产生多种有益表型，如促进植物生49 丁香假单胞大豆致病变种^r够基因的克隆及编码蛋白的纯化与功能研究长、诱导植物抗病、抗虫及抗逆等。据Dong等(1999)报道，拟南芥用harpinEa处理后可以增强对Psyringaepv．tomato和Phytophthoraparasitica的抗性。harpin处理番茄和烟草可在增强番茄对R．solaniciarium、Psyringaepv．tomato的抗性(QiuetaL，1997：闻伟刚，2001；李平，2002)，烟草对TMV、黑胫病(Phytophthoraparasiyicavar．nicotianae)、赤星病(Alternariaalternate)的抗性(闻伟刚，2001)。在田问，喷洒harpin还可以诱导多种经济作物对病害的抗性(Weieta1．，1996)。h唧ir她还可以诱导植物抗虫，促进植物生长(Qiueta／．，1997；Weietal．，1996)。此外，harpin在转基因烟草、番茄、水稻、棉花等作物中表达可以诱导防卫反应相关基因的表达，提高转基因植物的广谱抗病性(Huoeta／．，2009；Zhangetal．，2011)。由于harvin生化特征和生物效应的相似，因此不同来源的harpin可能采用类似的机制对植物产生影响。我们前期的研究从丁香假单胞大豆致病变种(Pseudomonassyringaepv．glycinea)中克隆表达并纯化了harpinZv。鳓蛋白，并且证明其具有harpha蛋白的理化特征，可以诱导非寄主植物烟草的过敏反应。本章对harpinZvsgsl诱导植物系统获得抗性方面进行了研究。为其将来在实际生产中的应用提供了实验基础。1材料和方法1．1菌株、培养条件和供试植物本研究所用的烟草疫霉(Phytophthoraparasiticavat．nicotianae)由本实验室在10℃下保存，使用前在V8培养基上25℃条件下生长。TMV由本实验室保存，使用前在新鲜烟草叶片上活化并确定使用浓度。采用的烟草品系是三生烟(NicotianatobacⅡ，竹aVganthamiana)．1．2培养基1．MS培养基采用购自北京西美杰公司的MURASHIGE&SKOOGBASAL删w／VITAMINGS试剂配制MS液体培养基，具体配制方法参照试剂说明，使用lmol／L的NaOH调PH值至5．8，分装后121℃高压灭菌15min。MS固体培养基，每1000mlMS液体中加入89琼脂粉。2．V8培养基取100mlV8汁加入lgCaCOs，4000rpm离心5min，取上清液与去离子水按照1：9的比例稀释，分装后121℃高压灭菌20min。 1．3harpinZpsgSl蛋白的表达参见第二章。1．4harpinZp。gSl蛋白的纯化参见第二章。1．5harpinZpsgsl蛋白的浓度测定参见第二章。1．6烟草叶片RNA的提取提取RNA所用到的所有耗材和器皿都要进行RNase清除处理。操作步骤如下：1．玻璃器皿于180℃的高温烘烤8h。2．塑料器皿可在O．5MNaOH中浸泡10min，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可彻底去除RNase。3．有机玻璃电泳槽等，先用去污剂洗涤，超纯水冲洗，乙醇干燥，再在过氧化氢中浸泡10min，然后用0．1％DEPC水冲洗，晾干。使用OMEGA公司PlantRNAKit(50次)试剂盒提取烟草叶片RNA。具体操作步骤如下：(1)植物叶片经液氮研磨后，收集堇100mg植物样品至离心管，加入50001BufferRCL／p．巯基乙醇混合液，马上涡旋混匀。每毫升RCL添加20山肛巯基乙醇，需预先混合。(2)55℃水浴1-3min，12000rpm室温离心5min。(3)把gDNA柱套在2ml收集管中，转移上清至gDNA过滤柱，12000rpm室温离心2min，保留滤液。(4)往滤液中加入等体积的BufferRCB，上下吸打，混匀5．10次。(5)把RNA柱套在2ml收集管中，转移一半混合液(<70001)至RNA结合柱上，12000rpm室温离心lmin，弃掉滤液。(6)转移余下混合液到RNA结合柱上，12000rpm室温离心lmin，弃掉滤液。(7)往柱子中加入40001RWCWashBuffer，12000rpm室温离心lmin，弃掉滤液和收集管，换一个新的收集管。(8)往柱子中加入500rdRNAWashBufferII，12000rpm室温离心lmin，弃掉滤液。 丁香假单胞大豆致病变种却z基因的克隆及编码蛋白的纯化与功能研究RNAWashBufferII在使用前需按照说明书正确添加乙醇稀释。(9)重复步骤8后，空柱子12000rpm室温离心2rain，干燥柱子。(10)把柱子套在一个新的1．5ml的离心管中，取30．50p．1DEPC水，准确添加在结合膜中央，常温放置2rain，12000rpm室温离心lmin洗脱RNA。1．7RNA的定性与质量检测制备琼脂糖凝胶(浓度1％)，取1山RNA溶液进行RNA的非变性电泳，检测RNA的完整性。质量较高的RNA在电泳后可以清楚看到28SrRNA、18SrRNA和5SrRNA三条带。若上样量少时，5SrRNA的条带可能会不清晰。从亮度来看，28SrRNA的亮度应该是18SrRNA亮度的2倍。如果28SrRNA的亮度不如18SrRNA条带，表明样品中有RNA降解。如果在点样孔内或附近有荧光区带，则表明RNA样品中有DNA污染。取2plRNA样品，加至分光光度计中，分光光度计预先DEPC水校正零点。高纯度的RNA应该是无DNA和蛋白污染的，其A260／A280比值(R)在1．9．2．1之间。RNA样品的OD260／OD2so比值若小于1．7，表明溶液中有蛋白或是其他有机物的污染，应当用酚／氯仿抽提去除蛋白质，用氯仿抽提去除残酚；当RNA样品的OD26徊D280比值大于2．2时，说明RNA已经水解成单核苷酸。OD260／OD230比值代表RNA中的盐离子浓度，OD260／OD230比值应该大于等于2，若小于2则表明裂解液中有异硫氰酸胍和p．巯基乙醇残留。1．8mRNA反转录cDNA采用TaI泳a公司的PrimerScript@ReverseTranscriptase试剂盒将mRNA反转录成cDNA。具体操作步骤如下：1．在微量离心管中配制下述反应液：Template1．0lagdNTPMixture(10raMeach)1．0I．tl01igodTPrimer(501jM)1．0wlRNase-freeH20upto10．0山2．轻柔混匀后，65℃保温5rain。3．迅速置于冰上冷却2min以上。4．离心数秒钟使模板RNA及引物等的混合液聚集于微量离心管底部。5．上述步骤完成后，再在微量离心管中配制下述反应液： 第一步的混合液5xPrimerScriptBufferRNaseInhibitor(40U／p1)PrimerScriptReverseTranscdptase(200U／id)10．0山4．OldO．5“I100-200UnitSRNase—freeH20U．pto20．01xl6．42。C反应lOmin。7．70℃反应15rain。8．反应结束后置于冰上冷却2min。1．9Real．timePCR本实验采用TaKaRa公司的SYBR⑩PremixExTaqTM(PerfectRealTime)试剂盒的说明书的方法设计Real．timePCR。1．9．1Real-timePCR引物的设计与合成EF．1aA3223969hsr515X95342内参基因，真核生物中高度保守HCD标志基因X77136HCD标志基因朋巴足』AF480488P4lX78269j碾．1aX05959X77110防卫相关基因，SAR正调控因子防卫相关基因，苯丙氨酸解氨酶基因PR蛋白家族基因PR蛋白家族基因，几丁质酶基因53Forward：AGACCACCAAGTACTACTGCACReverse：CCACCAATCTrGTACACATCCForward：TTGGGCAGAATAGATGGReverse：AACACCTCA(玲CTCGTCForward：TTATCTCCAATGCGACTGReverse：TCCrrGTTGCTCCCTACTForward：CTGGAGCAAGCAGAAAGRevelse"TC^TACGCAAA：rCATCGForward：CGATAGACTTGAGGCAITTReverse：GTTCTCCArDGOCACCCForward：GCGTI～ACTCGGTrCGTGReverse：TATGGACrrrCGC(、TCTForward：CGGCACTGCll℃TCACGReverse：TTCCATCGCTTCCAC，I：A 丁香假单胞大豆致病变种励够基因的克隆及编码蛋白的纯化与功能研究1．9．2Real-timePCR操作顺序1．将试剂盒内试剂上下颠倒混匀试剂，然后用离心机轻微离心收集后使用(注：避免用振荡器混匀，剧烈震荡会降低制品性能)。2．在冰浴条件下配制PCR反应混合液，分装至PCR反应管中。3．在冰浴条件下添加PCR扩增模板。4．在冰浴条件下，使用Real．timePCR扩增仪，进行PCR扩增(本实验用到ABIPRISM7300／7500FastReal-timePCRSystem)。1．9．3Real．timePCR反应液的配制(冰浴条件下进行)Real-timePCR反应液的配制需在冰浴条件下进行。·1通常引物浓度为0．2pM可以得到较好的效果。反应性能较差时，可以在0．1-1．0州范围内调整引物浓度。·2DNA模板的添加量通常在100rig以下。因不同种类的DNA模板中含有的靶基因的拷贝数不同，必要时可进行梯度稀释，确定最佳DNA模板添加量。+3ROXReferenceDyeII(50x)比ROXReferenceDye(50x)浓度低，使用7500Real-timePCRSystem和7500FastReal-timePCRSystem时，请使用ROXReferenceDyeⅡ(50×)。与使用ROXReferenceDye(50×)相比，校正后的荧光信号值高，但解析结果完全相同。‘496孔板。Single-Tube，8联Tube采用50山反应体系，384孔板。96-wellFastThermalCyclingplate采用20山反应体系。1．9．4Real-timePCR反应设置Real．timePCR按照说明书上两步法PCR反应程序设置如下： StagelReps95℃Stage2Reps95℃60℃DissociationStage·使用7700／7900HT时请设定30s：使用7000／7300时请设定31s：使用7500时请设定34s1．9．5Real．timePCR结果分析反应结束后，使用荧光定量PCR仪自带软件对扩增曲线和溶解曲线进行确认，进行PCR定量时制作标准曲线等。1．10烟草生长量的测定将纯化的harpinZPsgsl稀释后浸泡烟草种子，同时以清水为对照，置于4℃冰箱12h后吸出蛋白液，加入30％的NaCIO表面消毒5min，灭菌水清洗三次后倒置于灭菌的滤纸上，待种子吸干水后用灭菌牙签点入含MS培养基的方形培养皿中，置于光照培养箱中，垂直培养，每个处理设置5个重复。20d后观察，测定根长和鲜重，应用SPSS软件对数据进行统计分析。根长增长率％=(处理组植株主根长一对照组植株主根长)／处理组植株主根长x100％；鲜重增长率=(处理组植株鲜重一对照组植株鲜重)／处理组植株鲜重x100％。1．11烟草对TMV抗性的测定待烟草生长至5-6叶期时，使用100I_tg／ml纯化的harpinZp。ssl预先喷雾处理烟草中部叶片，以清水喷雾处理为对照。6h后在处理叶及其上、下各2张叶片摩擦接种烟草花叶病毒。摩擦接种的具体操作步骤如下：1．取病叶组织19加病毒接种物配制液1．5ml，在灭菌后冷却的研钵中研成匀浆。2．将匀浆用小块细纱布过滤到试管中，试管放在4"C冰箱中备用(接种液)。3．将少量石英砂(400目)撤在待接种叶片上，用移液器吸取一定量的TMV接种液均匀点滴在叶片上，用手指在叶面上轻轻摩擦接种。4．接种后的叶片用自来水轻轻冲洗，将试验植株置于22．25"C隔离温室中培养。～。弧一柏孤～P，． 丁香假单胞大豆致病变种h,-pz基因的克隆及编码蛋白的纯化与功能研究试验设置三个重复，48h．72h后调查叶片枯斑发生情况。诱抗效果=(清水处理的烟草叶片上的平均枯斑数--harpinZpsgsl处理的烟草叶片上的平均枯斑数)脯水处理的烟草叶片上的平均枯斑数x100％1．12烟草对烟草疫霉抗性的测定使用10099／ml纯化的harpinZvsgm预先喷雾处理烟草中部茎秆及其上下各一片叶子，以清水喷雾处理为对照。6h后以菌圆片夹茎法接种烟草疫霉病菌。疫霉接种的具体操作步骤如下：1．病菌在V8琼脂培养基上生长3d，用打孔器(直径5ram)打出菌圆片，接种到植株茎的中部(离地面约6cm)2．接种前，用解剖刀片在茎的中央切开lcm的切口，将一菌圆片放到切口内。3．用经消毒并用灭菌水浸泡的脱脂棉将切口周围包起来，用透明胶加固。4．接种后植株置于22-25℃隔离温室中培养。试验设置三个重复，3．7d内观察植物发病情况，拍照记录。2结果与分析2．1harpinZt,sgSl促进烟草的生长为了检测harpinZpsgsl是否可以促进植物生长，使用50-2001Jg／ml的harpinZpsgsl浸种处理烟草种子后播种于MS培养基上。实验结果表明，50-200l_tg／ml的h81"piI亿psssI对烟草均有明显的促生作用，相对于清水对照存在显著差异(图3．1，表3．1)，浓度为1001．tg／ml的harpinZp蹭S1促进根部生长率最高为26．3％，三个浓度之间并无显著性差异(表3-1)，不同浓度的harpinZpsgsl对烟草鲜重也具有促进作用，浓度为20099／ml的harpinZp。。sl促进鲜重增长率达50％，与另外两个浓度均存在显著性差异。 丁香假单胞大豆致病变种幻’z基因的克隆及编码蛋白的纯化与功能研究A●●．●·cdef"Ire氆meatB1霉13-2harpinZv昭sl诱导烟草抵抗唧唧的侵染Fig．3-2PhotosofharpinZps,gslinducedtobaccoagainstTMVinfectionA．ThelesionondifferentleavesinfectedbyTMV．1．CK；2．theleafbelowharpinZ隐,sl-treatedleaf；3．theleafaboveharpinZv删-treatedleaf；harpinZvsgsl-treatedleafB．ThelesionnumberoftobaccoleaveinfectedbyTMV．乱CK；bandc．theleafaboveharpinzP哂l-仃eatedleaf；dande．theleafbelowharpinZp哂l-treatedleaf；￡harpinZPsgsl·treatedleaf2．3harpinZPsgsl诱导烟草对烟草疫霉的抗性经harpir亿psgsl预处理后的烟草植株，可以有效提高对烟草疫霉的抗性。实验结果表明，接种疫霉3d后，对照组的烟草上病菌深入扩展到髓部，茎杆干缩使茎部的水分运输受阻，接种处茎秆凋零，而harpirIZpsgsI预处理过的的烟草茎杆在接种部位轻微病变发黑；接种疫霉5d后，对照组接种部位病菌已经扩展到顶端叶片，并出现倒伏症状，全株自下而上依次凋萎变黄，harpinZpsgsl处理组顶端叶片仍可以正常生长；接种疫霉7d后，对照组烟草全株枯萎死亡，harpinZpsgsl处理组仍可正常生长(图3—3)。■_『|j||||j||||||||1__1||l||||||’。l||J|| 堕茎堕查星三兰!!型些坠型墨旦至量塑兰茎堡墨竺垫堕堡塑堡塑里壅DD、Y[]3-3harpiⅡ：己P哂I诱导烟草抵抗疫霉的侵染Fig．3-3PhotosofharpinZPIgslinducedtobaccoagainstPhytophthoraparasiticainfection2．4harpinZp瞄l激发植物防卫反应相关基因的表达为了确定harpinZPsgsl诱导烟草抗病性增强是否是由于harp磁PsgSI诱导了烟草防卫反应基因的表达，以及分析诱导的防卫信号通路。我们采用了Real-timePCR的方法检测了24h内烟草体内防卫反应相关基因的表达情况。以清水处理的烟草叶片为对照，真核生物中高度保守并且组成性表达的EF-la为内参基因。实验结果表明，harpirlZPsgSI注射烟草叶片3h后HR标志基因hsr203j和hsr515开始有微量表达，6h达到最大表达量，随后表达量略有降低。到18h时hsr203j和hsr515再次达到最高表达量，随后表达量降低，24h后在注射区域出现肉眼可见的细胞坏死 丁香假单胞大豆致病变种胁罗Z基因的克隆及编码蛋白的纯化与功能研究(图3-4)。Oh3h6h8h12h18h24hT矗ne(hr)Oh3h6h8h12h18h24hThne(hr)图3-4harpinZrsgsl诱导hsr203j和hsr515表达情况Fig．3-4Theexpressionofhsr203jandhsr515intobaccoafterpretreatmentwithharpinZrnslTheplantsampleswerecollectedato'3，6，8，12，18，24hrespectivelyafterinfiltrationwithharpi略哂1orwater．TheharpinZv耗sltreatmentwasblackbarsandthewatertreatmentwaswhitebars同时，我们检测了防卫反应基因朋唿j和户I口Z的表达情况(图3．5)。harpinZpsgSl注射烟草叶片3h后NPRl开始有微量表达，6h达到最大表达量，随后表达量降低，18h时再次达到表达高峰。harpinZesgsl注射烟草叶片3h后凡z，开始有微量表达，6h达到最大表达量，随后表达量逐渐降低。鼬加印如∞如加mO^lIo一_g召磊=oo^I了B一舱笛-^聋|^^B醋0O0O巧加：2m5一口。一苗=。暑鼍∥QAI苗一0I)—u国，P0_ 雪童§暑=奏岜星麦2．52OOh3h6h8h12h18h24hT妇《llr)0h3h6h8h12h18h24hTime(b_r)图3-5harpinZvsssl诱导NPRl和Pal表达情况Fig．3-5TheexpressionofNPRlandPa／intobaccoafterpretreatmentwithharpinzP峭lTheplantsampleswe糟collectedat0，3，6’8，12’18，24hrespectivelyafterinfiltrationwithharpi屿|8sIOr啪慨TheharpinZv,ssttreatmentwasblackbarsandthewatA!rtreatmentwaswhitebars此外，我们检测了PR蛋白家族成员咫．J口和Chia5的表达情况。harpinZPsgsl注射烟草叶片6h后PR．妇开始有微量表达，随后表达量持续升高，24h达到最大表达量。Chia5在harpinZ№sl注射烟草叶片6h后开始有微量表达，但表达量并没有持续升高，到12h时达到第一个表达高峰，18h时达到最大表达量，此后略有下降。42O8642O(uo一苗基II再n；口uAI苗一世甾一～蔷参羁《 丁香假单胞大豆致病变种hrpZ基因的克隆及编码蛋白的纯化与功能研究：．·．●Oh3h6h8h12h18h24hTime(hr)0h3h6h8h12h18h24hThne(hr)图3-6harpinzP哂l诱导PR．J口和ChJaS表达情况rig．3-6TheexpressionofPR-laandChia5intobaccoafterpretreatmentwithharpinZ哪!TheplantsamplesWerecollectedato-3，瓯8，12，18，24hrespectivelyaff℃rinfiltrationwithharpinZv《s,orwalcETheharpinZv．锫slUeatmentwasblackbarsandthewatert陀atmentwaswhitebars多次实验都未能检测到乙烯信号通路的转录调控因子E1N2的表达，进一步说明harpinZpsgSt诱导植物对病原物的抗性是通过水杨酸信号通路激发的系统获得抗性。O0O柏弱如药加：2m5一IIo一董召磊tl∥oAI瓮一吐岛一～蔷≈重45352515O3210冒oI瓮=__哥r19。AI苗一让笛一—盈^f乐瞄 口DDWEfN2Oh3h曲8Il12h18h2411Tkne(hr)图3-7harpinz娜I诱导脚表达情况Fig．3-7TheexpressionofEIN2intobaccoaRerpretreatmentwimharpinZpsgstTheplantsampleswerecollectedat0，3，6，8，12，18，24hrespectivelyafterinfiltrationwithharpinZp≈s,orwater．TheharpinZp镏,sttreatmentWaSblackbarsandthewatertreatmentWaSwhitebars3讨论本研究实验结果表明外施harpinZpsgSI可以促进烟草的生长，显著提高烟草对TMV和疫霉的抗性，而且抗性不仅局限于harpinZ№sI处理的叶片，也包括处理周边的叶片及整株植物。本研究报道的harpinZpsgSl促进烟草生长的适宜浓度为50-2001．tg／ml，略高于以往报道的hpal硒15．301．tg／ml，这可能与其蛋白分子质量相对较大有关。因此，我们下一步工作希望找到harpinZpsgsI蛋白活性最小功能区域，构建harpinZp。gSl蛋白高效诱导功能的多肽。相对表达全长来说，短肽片段更易于体外表达，节约成本，利于微生物蛋白农药的产业化。植物抗病反应基因的诱导表达一直被视为植物抗病的分子标志，harpinZpsgsl注射烟草叶片后24h内，防卫反应相关基因hsr203J,hsrSl5、NPRl、Pal、PR-la、Chia5均不同程度的被诱导表达。hsr20M．hsr515是HR标志基因，而HR反应被认为是植物防卫反应的一种有效形式。NPRl是SAP．的正向调控因子，通过与转录因子互作的方式调控尸R．J『基因的表达，进而诱导植物的抗病表型。本研究中harpinZpsgSl处理的烟草叶片用t．J口表达量在24h内持续升高，24h达到表达高峰是清水处理的350倍左右。Pal(苯丙氨酸解氨酶)是植保素、木质素和酚类化合物合成的关键酶和限速酶，当烟草被harpinZp。删诱导后Pal出现上调表达趋势，进一步证明该过程与系统获得抗性表达存在相关性。Chia5是属于第1V类几丁质酶家族基因，研究表明TMV接种烟草时可以诱导Chia5的表达，同时Chia5可以抑制真菌菌丝的生长。上述实验结果均2l86420●O二o=暑I{口时弓o^T苗一Q幺)b醋≥∞幺 丁香假单胞大豆致病变种_llr砰基因的克隆及编码蛋白的纯化与功能研究表明harpinZPsgsI通过诱导植物防卫反应相关基因hsr203J．hsrSl5、NPRl、Pal、PR．J口、Chia5的表达赋予烟草对TMV及疫霉的抗性。多次实验都未能检测到乙烯信号通路的转录调控因子EIN2的表达，进一步说明harpinZpsgsl诱导植物对病原物的抗性是通过水杨酸信号通路激发的系统获得抗性。那么harpinZp。。Sl诱导乙烯／茉莉酸信号通路开启的时间点，以及与诱导水杨酸信号通路时序性是怎样的?harpinZPsgSl诱导上述三条信号通路的交叉对话又是怎样的?harpinZp。gSI在植物上作用位点?harpinZpsgsl的的晶体结构研究?这一系列问题都将是我们下一步研究的重点。 全文总结1．从本实验室已分离鉴定的丁香假单胞大豆致病变种(Pseudomonassyringaepv．glycinea)A1和S1菌株中克隆了harpin编码基因，命名为hrpZl,seAl和hrpZe,gsl。经过生物信息学分析将丁香假单胞大豆致病变种harpin编码基因分为两类，这两类hrpZ基因的核苷酸同源性为79％，氨基酸同源性为77％。2．利用GST基因操作系统获得了hrpZp刚J和hrpZp,gst的基因产物，分别命名harpinZpsgAi和harpinZesgsI，对harpinZp路SI进行了纯化，每升BL21／pET41a(+)-hrpZesgsl发酵液经High．AffinityGSTResin纯化，可提纯harpinZp昭SI蛋白约20mg。3．harpinZvsgsl对热稳定，对蛋白K敏感，可以在非寄主植物烟草上激发过敏反应，并且过敏反应可以被真核生物代谢抑制剂所抑制，具备harpin蛋白的生物学特征。harpinZpsgsl激发HR的最小浓度为100¨g／ml，低浓度的harpinZp蹭SI虽然不能激发肉眼可见的腿，但可以激发micro-HR。4．harpinZl,sgsl可以促进烟草的生长，显著提高烟草对TMV和疫霉的抗性，而且抗性不仅局限于harpinZ哑sl处理的部位，也包括处理周边的叶片及整株植物，是一种系统获得抗性。5．harpinZp铭sl激发的HR．伴随着HCD标志基因hsr203J,hsr515的表达，同时伴随SAR正调控因子NPRl，植保素合成限速酶基因Pal，PR蛋白家族基因PR．1a、Chh25的表达，但未检测到乙烯信号通路的转录调控因子EIN2的表达，说明harpinZpsgsI诱导烟草产生的SAR是依赖于水杨酸信号通路的。 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