3-苯氧基苯甲酸纳米抗体识别特性及免疫分析方法研究

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1、学校代码：10564学号：2016308605分类号：TS207.3密级：硕士学位论文3-苯氧基苯甲酸纳米抗体识别特性及免疫分析方法研究郭城钎第一指导教师：徐振林副教授第二指导教师：刘辉高级工程师学院名称：食品学院专业学位类别：农业硕士领域：食品加工与安全答辩委员会主席：毛丽梅教授中国·广州2018年6月I摘要3-苯氧基苯甲酸（3-phenoxybenzoicacid,3-PBA）是拟除虫菊酯类农药最常见的代谢产物，通常可作为其重要的风险暴露评估指标。基于抗原-抗体特异性结合的免疫分析法具有快速、灵敏、简便等优点，在有害物风险暴露评估中有较好应用

2、前景。本研究在前期已制备获得3-PBA纳米抗体的基础上，对其表达条件进行优化，并大量制备及纯化3-PBA纳米抗体，通过蛋白质结晶技术研究3-PBA纳米抗体识别特性，并建立间接竞争酶联免疫分析方法，用于实际样品的检测。主要研究内容及结果如下：（1）3-PBA纳米抗体表达条件优化及大量制备采用正交实验研究培养基、表达温度、表达时间、IPTG用量对3-PBA纳米抗体表达量的影响，结果表明最佳表达条件为：SB培养基、表达温度为37°C、表达时间12h、诱导剂IPTG含量1mmol/L，最终蛋白表达量为3mg/L。采用镍柱对表达产物进行纯化，SDS-PAG

3、E凝胶电泳进行纯度鉴定，间接竞争ELISA进行活性鉴定，结果表明所获得的3-PBA纳米抗体纯度较高，活性较好。（2）3-PBA纳米抗体识别特性研究将纳米抗体与3-PBA配体混合并优选其结晶缓冲溶液，结果表明10mmol/LHEPES（含50mmol/LNaCl）为最优结晶缓冲液。3-PBA纳米抗体饱和浓度为6.5mg/mL，药物配体复合物饱和浓度6.8mg/mL。结晶条件初筛和优化后，共获得9株配体蛋白质晶体，采用X-衍射得到其中1株分辨率为1.95Å的配体蛋白质晶体数据，其结晶条件为：0.2mol/L醋酸铵、0.1mol/LpH为4.6的醋酸钠

4、、30%(w/v)PEG4000。经初步结构解析，加入配体后优化数据为：R-work0.2306，R-free0.2516，Bonds0.003，Angles0.600。3-PBA纳米抗体中Phe-36，Arg-61，Tyr-99，Tyr-104，Tyr-106，Phe-109等多数带有苯环结构的残基侧链形成疏水相互作用，与3-PBA主要存在π-π相互作用。Asn-99，Gly-102，Tyr-104氨基酸残基侧链与3-PBA形成氢键，键距离均小于3Å，属强相互作用。3-PBA纳米抗体共有两个二硫键，其中Cys-22与Cys-93形成的二硫键位于

5、骨架区，而Cys-50与Cys-101形成的二硫键位于CDR3区，证明了其具有高稳定性，这为后续进行纳米抗体性能改造奠定了基础。（3）基于3-PBA纳米抗体间接竞争酶联免疫方法建立及应用将3-PBA纳米抗体生物素化，利用多聚HRP酶标记的链霉亲和素进行信号扩增，II建立检测3-PBA的高灵敏间接竞争ELISA检测方法，在最佳反应条件下，所建立方法对3-PBA的检测限（limitofdetection,LOD）为0.15ng/mL，IC50为1.7ng/mL，线性检测范围（IC20~IC80）0.37~7.4ng/mL。将该方法用于环境水样品和人尿

6、样品中3-PBA的检测，添加回收率分别为78%~127%和84%~113%，表明本方法适用于实际样品检测。关键词：3-苯氧基苯甲酸；纳米抗体；蛋白质晶体；免疫分析IIIStudyoftheCharacteristicsof3-phenoxybenzoicAcidNanobodyandDevelopmentofCompetitiveIndirectELISAGuoChengqian(CollegeofFoodScience,SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou510642,China)Abstract

7、:3-phenoxybenzoicacid(3-PBA),asthecommonmetaboliteofpyrethroidpesticides,istypicallyemployedastheriskindicatorofpyrethroidpesticidesexposure.Antibody-antigenbasedimmunoassayhasadvantagesofrapidity,highsensitivityandeasy-to-operate,thusisconsideredasapromisingtoolforriskexposu

8、reassessment.Inthiswork,basedontheprevioussuccessinproducingnanobody