3-苯氧基苯甲酸降解基因的克隆与表达

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1、密级:论文编号:中囯农业科学院学位论文3-苯氧基苯甲酸降解基因的克隆与表达CloningandExpressionoftheGeneDegrading3-PhenoxybenzoicAcid硕士研宄生：梁俊仕指导教师：许雷研宄员I申请学位类别：理学硕士专业：生物化学与分子生物学研宄方向：微生物分子生物学与基因工程培养单位：研究生院提交日期2015年5月独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或

2、其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：@Kt时间：年/月今曰关于论文使用授权的声明本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。时间：•年（月斗日中国农业斜学院硕士学位论文评阅人、答辩委员会签名表论文题目3-苯氧基苯甲酸降解基因的克隆与表达生物)化

3、学与微生物分子生物i论文作者木1欠江71分子生物学研宄方向学与基因工程指导教师许雷培养单位（研宄所）研宄生院硕（博）姓名职称单位专业签名导师评硕导口中国农业科学院生物化学与王志兴研究员博导■生物技术研究所分子生物学阅硕导口农业昆虫与关雄教授福建农林大学人博导■害虫防治答硕导口中国科学院姚一建研究员分子生物学主博导■微生物研究所席硕导口中国农业科学院张杰研究员微生物学博导■植物保护研宄所硕导口侯玉霞教授中国农业大学理学院分子生物学.博导■答硕导口中国农业科院王凤忠研究员微生物学博导■农产品加工研究所辩硕导■中国农业科学院谢明研究员微生物学•识也博导口植物

4、保护研究所委1员会议记录（秘书）陈度宇论文答辩时间地点2015年5月31日研究生院第一会议室密级:论文编号:中国农业科学院学位论文3-苯氧基苯甲酸降解基因的克隆与表达CloningandExpressionoftheGeneDegrading3-PhenoxybenzoicAcid硕士研究生：梁俊仕指导教师：许雷研究员申请学位类别：理学硕士专业：生物化学与分子生物学研究方向：微生物分子生物学与基因工程培养单位：研究生院提交日期2015年5月Secrecy:No.ChineseAcademyofAgriculturalSciencesDissertati

5、onCloningandExpressionoftheGeneDegrading3-PhenoxybenzoicAcidM.S.Candidate：LiangJunshiAdvisor：ProfessorXuLeiMajor：BiochemistryandMolecularBiologySpecialty：MicrobialMolecularBiologyandGeneticEngineeringMay2015摘要3-苯氧基苯甲酸（3-PBA）是菊酯类农药生物降解途径中的第一个代谢产物。3-PBA的半衰期较菊酯类农药更长（180d），生物毒性更大，研究

6、证实3-PBA具有抗雌激素的特性，可紊乱生物体内分泌代谢。因此开展3-PBA的生物降解研究，克隆降解基因，对保障生态安全有重要意义。本研究以实验室分离的菊酯农药降解菌株4-D为出发材料，构建4-D菌基因组文库，以3-PBA为唯一碳源的无机盐平板为筛选平板，通过混合池驯化筛选获得可以3-PBA作唯一碳源的重组菌4D-3-4，通过测序比对并分析插入片段，经ORF分析得到921bp的完整阅读框，该核苷酸序列命名为D34（Genebank登录号为KR024742），经过Blast比对和生物软件分析，其应为邻苯二酚双加氧酶，是4-D菌降解3-PBA过程中起主要作

7、用的基因。运用Swiss-Model对该基因编码产物进行了氨基酸结构分析和三级结构预测。氨基酸序列长度为306aa,Aligned蛋白数量为47，PDB结合结构数量为13，该蛋白不含二硫键，具有两个结构2+域，酶活位点位于第一结构域，第二结构域与蛋白折叠和跨膜相关，其正确折叠需要Ca参与。根据D34完整阅读框序列设计引物，并在引物两端分别加上NdeI和HindⅢ识别位点，以原始菌株基因组DNA为模版，成功克隆到921bp的D34基因序列。以pET-21b为载体，BL21（DE3）为宿主菌，构建了D34基因的非融合原核表达载体，并进行了诱导表达。对重组表

8、达菌株进行了3-PBA的降解性能研究，对表达产物进行了SDS-PAGE验证分析和酶部分理化性质