利用稀禾定筛选高生长高油脂的寇氏隐甲藻突变株及转录分析

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1、利用稀禾定筛选高生长高油脂的寇氏隐甲藻突变株及转录分析Screeningandtranscriptomicanalysisofhighgrowthandlipid-contentmutantsofCrypthecodiniumcohniiusingsethoxydim学科专业：制药工程作者姓名：刘晶指导教师：张卫文教授天津大学化工学院二零一七年十二月摘要寇氏隐甲藻（Crypthecodiniumcohnii）是一种异养海洋微藻，其体内DHA含量占油脂含量的30-50%，而体内其他多不饱和脂肪酸含量占油脂含量的比例都达不到1%。

2、由于这些优势，近些年来寇氏隐甲藻已经被广泛应用于DHA的工业化生产中。但是，到目前为止，寇氏隐甲藻的全基因组序列测序还没有被完成，限制了基因工程在寇氏隐甲藻中应用，人们无法通过基因改造的方式获得性状更为优良的寇氏隐甲藻突变株。因此，诱变育种仍然是获得高产寇氏隐甲藻突变株的主要方式。在本研究中，我们发现一定浓度的乙酰辅酶A羧化酶活性抑制剂稀禾定能够显著抑制寇氏隐甲藻的生长。因此，我们提出选用稀禾定作为一种突变株筛选剂，用于筛选乙酰辅酶A羧化酶活性增强同时生长和油脂含量有所提高的突变株。为了实现这一目标，我们将常压室温等离子体（A

3、RTP）诱变技术与基于稀禾定的突变株筛选方法相结合，并成功应用于寇氏隐甲藻中，经过两轮诱变筛选，成功获得了高产的寇氏隐甲藻突变株。我们得到的寇氏隐甲藻突变株M-1-2，与野生株WT相比，其干重和油脂分别提高了24.32%和7.05%，证明了基于稀禾定的筛选方法的有效性。与上述结果相一致的，乙酰辅酶A羧化酶活性的测定结果表明突变株M-1-2体内的乙酰辅酶A羧化酶活性提高了16.15%；转录组学分析结果显示突变株M-1-2体内的编码乙酰辅酶A羧化酶的基因表达量上调了1.53-3.12倍。此外，转录组学分析结果表明，与寇氏隐甲藻野生

4、株WT相比，突变株M-1-2体内的与油脂合成、能量代谢、中心碳代谢及氨基酸代谢相关的转录本的表达量也上调。通过转录组学分析获得的信息不但能够帮助我们更好的理解寇氏隐甲藻的代谢机制，而且有助于实现未来高产寇氏隐甲藻藻株的工程改造。关键词：稀禾定，筛选，转录组，常压室温等离子体，寇氏隐甲藻IABSTRACTTheheterotrophicmarinemicroalgaCrypthecodiniumcohniicanaccumulateDHAthatmakesupnearly30-50%ofitsconstituentfattyac

5、ids,andmeanwhileaccumulateslessthan1%oftheothertypeofPUFAs.Duetotheseadvantages,ithasbeenwidelyusedinindustrialfermentationforalgalDHAproductioninrecentyears.However,sofarthewholegenomesequenceofC.cohniihasnotbeencompleted,whichhasredistrictedtheapplicationofmorerad

6、icalgeneticengineeringapproachtoobtainC.cohniimutantswithbetterbiologicalproperties.Alternatively,high-yieldmutantsofC.cohniicanbeobtainedusingsuitablemutagenesisandhigh-efficiencyscreening.Inthestudy,ahigh-concentrationofsethoxydimwasfoundtoinhibittheC.cohniigrowth

7、significantly.WethusproposedtoapplysethoxydimasaselectiveagenttoscreenmutantswithincreasedACCaseactivity,andpossiblyincreasedgrowthandlipid-contentaswell.Towardsthisgoal,anintegratedARTPmutagenesisandsethoxydim-basedscreeningprotocolwasappliedtoC.cohniifortworounds,

8、leadingtotheidentificationofseveralmutantswithhighgrowthandlipid-content.TheeffortsledtoidentificationofamutantM-1-2with24.32%highergrowth