枯草芽孢杆菌营养缺陷型突变株筛选

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1、题目：细菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选鉴定一、实验原理：筛选营养缺陷型菌株一般具有四个环节：诱变处理、营养缺陷性的浓缩、检出、鉴定缺陷型。本实验选用亚硝酸钠为诱变剂来诱发突变，并用青霉素法淘汰野生型，逐个测定法检出缺陷型，最后经生长谱法鉴定细菌的营养缺陷型。二、实验器材：离心机，冰箱，恒温箱，高压灭菌锅；接种针，三角烧瓶，试管，离心管，移液管，培养皿，枪头三、菌种：大肠杆菌四、所有用到的培养基：（分别列出配方）1.LB培养液：酵母膏，0.5g；蛋白胨，1g；NaCl，0.5g；水，100ml，pH7.2121℃灭菌15min2.基本培养基：葡萄糖0.5g，(NH4)2SO40.1g，柠檬酸钠0

2、.1g，MgSO4·7H2O0.02g，K2HPO40.4g，KH2PO40.6g，重蒸水100mL，pH7.2，110℃灭菌20min。配固体培养基时需加2%洗涤处理过的琼脂。全部药品需用分析纯，使用的器皿需用蒸馏水或重蒸水冲洗2~3次。3.无N基本液体培养基：K2HPO4,0.7g；KH2PO4,0.3g;柠檬酸钠3H2O,0.5g；MgSO47H2O,0.01g;葡萄糖2g；水100ml，pH7.0110℃灭菌20min4.2N基本培养基：K2HPO4,0.7g；KH2PO4,0.3g;柠檬酸钠3H2O,0.5g；MgSO47H2O,0.01g;(NH4)2SO4,0.2g;葡萄糖2g

3、；水100ml，pH7.0110℃灭菌20min5.完全培养基同LB培养基，配置固体培养基，需加2%的琼脂。6.补充培养基(简称SM)：为满足某特定营养缺陷型菌株的营养要求而在基本培养基中加入某—种或几种营养成分的培养基称补充培养基。7.醋酸缓冲液(pH4.5)（取醋酸钠18g,加冰醋酸9.8ml,再加水稀释至1000ml）、0.1mol/L亚硝酸钠溶液(68.995×0.1=6.8995g/L)、0.07mol/L酸氢二钠溶液(pH8.6)(141.96×0.07=9.9372g/L)五、实验步骤1thday:各种所需培养基、试剂的配制及所需器材灭菌2thday：菌体活化与培养：取一环E.

4、coli于5mlLB液体三角瓶中，37℃培养过夜，14~16h.3thday：早上添加5mlLB液，充分混匀后，分装到两只三角瓶，继续培养5小时。将两瓶菌液分别倒入离心管中，离心（3500rpm）10分钟，弃上清，其中一管加生理盐水5ml，打匀沉淀，然后倒入另一离心管中，两管合并成一管。（菌体密度控制在10*7~10*8个/mL）。LB液体10ml、生理盐水、两个100ml三角瓶、5ml离心管*2、菌液浓度测定比浊计数法（OD600=1,枯草芽孢杆菌浓度为6×10*个/mL）。亚硝酸钠(NIT)诱变:取菌悬液1mL、醋酸缓冲液(pH4.5)2mL、0.1mol/L亚硝酸钠溶液1mL,于26摄

5、氏度下保温25min后每个样中,加入0.07mol/L磷酸氢二钠溶液(pH8.6)20mL,以终止反应。然后取诱变菌液1mL稀释涂布于LB琼脂平板上，在30℃下培养48h后进行菌落计数，计算致死率.无菌水20ml、平皿15个、300mlLB固体、10ml移液管、醋酸缓冲液(pH4.5)（三）营养缺陷型浓缩（淘汰野生型）3thday：延迟处理：吸菌液5ml于离心管中，3500rpm离心10min，弃上清。离心洗涤两次（加生理盐水至原体积，打匀沉淀，离心，弃上清，重复一次），最后加生理盐水制成5ml菌悬液。取0.1ml菌液于5ml无N培养基中，10ml无N、100ml三角瓶、枪头、5ml离心管3

6、7℃培养12h。4thday：初筛：加入等体积2N基本培养液5ml，加5万U/ml青霉素钠盐溶液100ul(1国际单位（IU）=0.60μg结晶青霉素G钠盐＝0.625μg结晶青霉素G钾盐)，使青霉素在溶液中的最终浓度约为500U/ml(青霉素母液过滤除菌后加入），再放入37℃培养。2N基本培养液10ml、5万U/ml青霉素钠盐溶液（四）营养缺陷型检出5thday：从培养12、16、22小时（根据实际情况，选择2-3个时间段）的菌液中分别取0.1ml菌液到基本及完全培养基两个培养皿中，涂布，37℃培养。7thday：检出营养缺陷型。上述平板培养36－48h后，进行菌落计数。基本及完全培养基各

7、200ml、平皿18个（五）复证：选取完全培养基上长的菌落数大大超过基本培养基的那一组，用灭菌牙签挑取完全培养基上长出的菌落100个分别点种于基本培养基和完全培养基上（先基本，后完全），37℃培养。9thday：选在基本培养基上不长，完全培养基上生长的菌落在基本培养基上划线，37℃培养24h，仍不长的是营养缺陷型。基本、完全、平皿待定(六)生长谱测定使用以下四种营养物质：a.不含维生素的酪素水解液或氨基酸混合