枯草芽孢杆菌分离及筛选实验方案

枯草芽孢杆菌分离及筛选实验方案

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时间:2018-08-08

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1、微生物设计性实验枯草芽孢杆菌的分离及筛选第二小组组长:杨泽升组员:王亭亭叶宁霍克枯草芽孢杆菌的分离和筛选1实验目的掌握枯草芽孢杆菌的分离筛选的基本原理,熟练掌握无菌接种技术、微生物分离筛选技术和微生物形态观察技术。了解枯草芽孢杆菌的分布、营养、生长等特点,以及它所具有的产淀粉酶的功能。根据这些特点进行分离和筛选,从而得到纯菌株。2实验原理枯草芽孢杆菌属革兰氏阳性菌,芽孢0.6~0.9×1.0~1.5微米,椭圆到柱状,位于菌体中央或稍偏,芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明,污白色或微黄色,在液体培养基中生长时,常形成

2、皱醭。需氧菌。有的菌株是α-淀粉酶和中性蛋白酶的重要生产菌;有的菌株具有强烈降解核苷酸的酶系。广泛分布在土壤及腐败的有机物中,易在枯草浸汁中繁殖,故名。选择含淀粉丰富的土壤为最佳,80度的水浴处理样品1小时,目的是杀死微生物营养体,残留芽胞。利用稀释涂步法,在淀粉的培养基培养,培养1-3天后,观察。然后,进行初筛与纯化,鉴定参照《伯杰氏细菌手册》鉴定或者利用显微镜进行革兰氏染色,确认是否为枯草芽孢杆菌。再复筛,测定其淀粉酶活,最后确定菌株。3实验材料3.1选择培养基本次实验进行产淀粉酶的枯草芽孢杆菌的筛选,所以应选淀粉培

3、养基,配方:牛肉膏5.0g蛋白胨10.0g氯化钠5.0g可溶性淀粉10.0g琼脂20g蒸馏水1000ml调整pH至7.2配置时应先把淀粉用少量蒸馏水调成糊状,再加入到融化好的培养基中。3.2溶液或试剂牛肉膏1.25g蛋白胨2.5g氯化钠1.25g可溶性淀粉2.5g琼脂5g碘11克,碘原液2毫升,碘化钾42克,可溶性淀粉2克,磷酸氢二钠45.23克,柠檬酸8.068克,氯化钴25克,重铬酸钾3.34克,100毫升0.01NHCL。3.4仪器或其他用品平板培养皿10个、试管15支、三角瓶2个、烧杯3个、称量纸、高压蒸汽灭菌锅

4、、干燥箱、恒温培养箱、超净工作台、无菌涂布器、电热恒温水浴、500ml量筒、显微镜、无菌吸管、无菌培养皿、无菌刻度吸管、酒精灯、记号笔、火柴、试管架、接种钩、滴管等。4实验流程倒平板→制备梯度稀释液→涂布→培养→初筛→复筛→纯化→保存5实验步骤实验前准备制备淀粉培养基,无菌水,在121摄氏度下灭菌20min。倒平板。把接种工具,培养基,和其他用品全部在超净工作台上摆好,进行紫外线灭菌30min。5.1制备土壤稀释液取土样时最好选取如花坛等地方的土样,选好采样地点,产去表层5cm,去5-15cm处。用无菌器具规范采样几十克

5、,装入无菌的塑料袋或纸袋中扎好,记录采样时间、地点、采样环境等以备考证。采样后应尽快分离。振摇约二十分钟,使土样与水充分混合,将细胞分散。放入盛有99ml无菌水三角瓶中,常压80度的水浴处理样品1小时后,取出。用一支1ml无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀,然后用无菌吸管从此试管中吸取1ml加入另一盛有9ml无菌水的试管中,混合均匀,以此类推,制成10-2、10-3、10-4、10-5不同稀释度的土壤溶液。5.2涂布将上述每种培养基的三个平板底面分别用记号笔写上10-3、10-4、10-

6、5三种稀释度,然后用无菌吸管分别由10-3、10-4、10-5三管土壤稀释液中各吸取0.2ml,小心地滴在对应平板培养基表面中央位置。用无菌涂布器涂布。右手拿无菌涂布器平放在平板培养基表面上,将菌悬液先沿同心圆方向轻轻地向外扩展,使之分布均匀。室温下静置5-10min,使菌液浸入培养基。5.3培养将淀粉培养基平板倒置于30°C培养箱中培养1—3d。5.4初筛观察菌落表面粗糙不透明,呈污白色或微黄色,将这样的菌种单个菌落分别挑取少许细胞接种到培养基上,置于30°C的培养箱中培养,若发现有杂菌,需要再一次进行分离纯化。(如不

7、能用肉眼更好的观察,可对其进行革兰氏染色,在显微镜下观察,与标准菌种比较。)5.8复筛测定其淀粉酶活。5.8.1试剂和器材1试剂:(1)碘原液:称取碘11克,碘化钾22克,加水溶解,稀释至500毫升。(2)稀碘液:取碘原液2毫升,加碘化钾20克,稀释至500毫升,此试剂随配随用。(3)2%淀粉液:称取干燥过的可溶性淀粉2克,加5毫升蒸馏水,搅拌混和,再徐徐倾入70毫升煮沸的蒸馏水中。继续煮沸2分钟,冷却至室温,加入磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(PH为6)(4)柠檬酸缓冲液:称取磷酸氢二钠(Na2HPO4?12H2O)45.2

8、3克,柠檬酸(C6H8O7?H2O)8.068克,加水溶解,稀释至1000毫升。(5)标准比色液:称取氯化钴(CoCL2?6H2O)25克和重铬酸钾3.34克溶于100毫升0.01NHCL,其五倍稀释作标准。(6)样品:细菌-α淀粉酶2器材(1)电热恒温水浴(2)试管(3)量筒(4)吸量管(1ml)5.8.2操作方法

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