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时间:2019-03-03
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1、安徽农业大学硕士学位论文离子注入盐生杜氏藻高产β-胡萝卜素突变株筛选及细胞固定化技术研究姓名:杨润柏申请学位级别:硕士专业:生物物理学指导教师:程备久20080601摘要杜氏盐藻(Dunaliellasalina)是一种单细胞真核藻类,无细胞壁,含有大量的甘油、胡萝卜素和蛋白质,是极具经济价值和研究价值的藻类。本文利用低能离子束对盐生杜氏藻进行诱变,选育高产13.胡萝卜素的突变菌株,并针对单粒子单细胞辐照的要求,进行了盐藻细胞固定化技术研究,获得如下主要结果:1.利用10keV能量下不同剂量的低能氩离子注入盐藻,研究了盐藻细胞的
2、存活率和突变率,确定了盐藻氩离子注入最适剂量为1.04x1015A—cm2。2.通过多轮诱变筛选,获得了一株高产B.胡萝卜素的盐藻突变株,命名为CH2,其13一胡萝卜素总含量为15.075mg/L,单细胞B一胡萝卜素含量为2.258pg/cell,比原藻株提高了42%。对该藻株进行传代实验,结果表明该藻株在合成B.胡萝卜素性状上具有遗传稳定性。3.研究了盐藻突变株和原藻株的生长及主要色素积累的变化。结果表明,离子注入后盐藻正突变株生长曲线相对于原藻株有明显上升,生长速度增大,B一胡萝卜素总含量从原来的8.598mg/L增加到14
3、.397mg/L以上,单细胞13一胡萝卜素含量从原来的1.59pg/cell增加到1.996pg/cell以上,叶绿素含量与13一胡萝卜素含量的比值从原来的2.837mg/L下降到2.088mg/L,说明盐藻在进入稳定期之前积累B一胡萝卜素的过程与细胞的生长正相关,只是突变株的生长在进入稳定期后仍有增长空间,B一胡萝卜素在不断累积,叶绿素含量虽有增加,但增长幅度渐趋缓慢。4.建立了盐生杜氏藻细胞固定化技术体系:对数期第6.7天,NaCI含量为30∥L,细胞固定剂【广多聚赖氨酸(PLL)浓度为1.25mg/mL,剂量为lmL,固定
4、区域直径为2mm,FDA浓度为5mg/mL,剂量为400pL,PI浓度为400}tg/L,剂量为210“L,为适合的固定化条件。胰蛋白酶洗脱时间为3"一'4min,洗脱剂量240---,250¨L,J'b力n60rpm培养12h可完全洗脱固定细胞。综上所述,本研究所建立的盐藻离子束辐照技术和获得的高产B一胡萝卜素突变株及单细胞固定化技术,为盐藻的遗传改良和单细胞定位辐照奠定了理论和技术基础。关键词:盐生杜氏藻13.胡萝卜素离子注入单细胞固定AbstractDunaliellasalina(Chlorophyta,Chloroph
5、yceae)isaunicellularwall-lessbiflagellatealga,coatedbyGlycoproteinandNeuraminicacid.Itcontentplentyofglycerol,carotene,proteinandmulti—vitamine,SOitisworthyofeconomyandresearch.InthispaperasysteminvestigationhadbeendoneontheionsimplantationfactorsofDunaliellasalinaan
6、deffecttothecellgrowthand13-caroteneaccumulationofthemutantstrains.Asystemstudyalsohadbeendoneonthealgafixationtechnologyintermsofmicrobeamradiationconditions.Theresultsasfollows:1.ByAr+ionsimplantationwithdifferentdosesof10keVenergy,westudiedthecellsurvivalrateandmu
7、tationrateandconfirmedthattheoptimumAr+ionsimplantationdoseis1.04×1015Ar+/em2.2.Alligh—yield13一carotenemutantstrainnamedCH2Wasobtainedafterfewroundsofscreening,whose13一carotenetotalcontentis15.075mg/LandsinglecellB-carotenecontentis2.258pg/cell,whichhasincreased42%in
8、contrasttotheoriginalstrain.Aftertransferredgenerationexperiments,itisfinallyindicatedthatthisalgaehadthehereditystabilityinthesynt
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