离子注入盐生杜氏藻高产β-胡萝卜素突变株筛选及细胞固定化技术研究

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1、安徽农业大学硕士学位论文离子注入盐生杜氏藻高产β-胡萝卜素突变株筛选及细胞固定化技术研究姓名：杨润柏申请学位级别：硕士专业：生物物理学指导教师：程备久20080601摘要杜氏盐藻(Dunaliellasalina)是一种单细胞真核藻类，无细胞壁，含有大量的甘油、胡萝卜素和蛋白质，是极具经济价值和研究价值的藻类。本文利用低能离子束对盐生杜氏藻进行诱变，选育高产13．胡萝卜素的突变菌株，并针对单粒子单细胞辐照的要求，进行了盐藻细胞固定化技术研究，获得如下主要结果：1．利用10keV能量下不同剂量的低能氩离子注入盐藻，研究了盐藻细胞的

2、存活率和突变率，确定了盐藻氩离子注入最适剂量为1．04x1015A—cm2。2．通过多轮诱变筛选，获得了一株高产B．胡萝卜素的盐藻突变株，命名为CH2，其13一胡萝卜素总含量为15．075mg／L，单细胞B一胡萝卜素含量为2．258pg／cell，比原藻株提高了42％。对该藻株进行传代实验，结果表明该藻株在合成B．胡萝卜素性状上具有遗传稳定性。3．研究了盐藻突变株和原藻株的生长及主要色素积累的变化。结果表明，离子注入后盐藻正突变株生长曲线相对于原藻株有明显上升，生长速度增大，B一胡萝卜素总含量从原来的8．598mg／L增加到14

3、．397mg／L以上，单细胞13一胡萝卜素含量从原来的1．59pg／cell增加到1．996pg／cell以上，叶绿素含量与13一胡萝卜素含量的比值从原来的2．837mg／L下降到2．088mg／L，说明盐藻在进入稳定期之前积累B一胡萝卜素的过程与细胞的生长正相关，只是突变株的生长在进入稳定期后仍有增长空间，B一胡萝卜素在不断累积，叶绿素含量虽有增加，但增长幅度渐趋缓慢。4．建立了盐生杜氏藻细胞固定化技术体系：对数期第6．7天，NaCI含量为30∥L，细胞固定剂【广多聚赖氨酸(PLL)浓度为1．25mg／mL，剂量为lmL，固定

4、区域直径为2mm，FDA浓度为5mg／mL，剂量为400pL，PI浓度为400}tg／L，剂量为210“L，为适合的固定化条件。胰蛋白酶洗脱时间为3"一'4min，洗脱剂量240---,250¨L，J'b力n60rpm培养12h可完全洗脱固定细胞。综上所述，本研究所建立的盐藻离子束辐照技术和获得的高产B一胡萝卜素突变株及单细胞固定化技术，为盐藻的遗传改良和单细胞定位辐照奠定了理论和技术基础。关键词：盐生杜氏藻13．胡萝卜素离子注入单细胞固定AbstractDunaliellasalina(Chlorophyta，Chloroph

5、yceae)isaunicellularwall-lessbiflagellatealga，coatedbyGlycoproteinandNeuraminicacid．Itcontentplentyofglycerol，carotene，proteinandmulti—vitamine，SOitisworthyofeconomyandresearch．InthispaperasysteminvestigationhadbeendoneontheionsimplantationfactorsofDunaliellasalinaan

6、deffecttothecellgrowthand13-caroteneaccumulationofthemutantstrains．Asystemstudyalsohadbeendoneonthealgafixationtechnologyintermsofmicrobeamradiationconditions．Theresultsasfollows：1．ByAr+ionsimplantationwithdifferentdosesof10keVenergy,westudiedthecellsurvivalrateandmu

7、tationrateandconfirmedthattheoptimumAr+ionsimplantationdoseis1．04×1015Ar+／em2．2．Alligh—yield13一carotenemutantstrainnamedCH2Wasobtainedafterfewroundsofscreening，whose13一carotenetotalcontentis15．075mg／LandsinglecellB-carotenecontentis2．258pg／cell，whichhasincreased42％in

8、contrasttotheoriginalstrain．Aftertransferredgenerationexperiments，itisfinallyindicatedthatthisalgaehadthehereditystabilityinthesynt