《细菌转化》PPT课件

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1、试验四质粒的转化与鉴定孔忠新2011.02.20实验目的学习掌握质粒转化的原理和一般技术2.学习和掌握重组质粒的检测原理与方法放大某一基因片段，用于探针、基因功能检测、报道基因研究等。携带目的基因的重组质粒在大肠杆菌中进行表达。PCR产物的克隆和测序。构建基因库、cDNA库等。纯化基因片段为什么需要质粒转化实验原理关于载体——质粒质粒是一类双链、闭环的DNA分子，存在于细菌体中，独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。通过改造，实验室常用质粒被赋予了以下几种特性：1．含有多克隆位点区域，可方便地插入目的DNA片段。2．对细菌的可转移性，即在实验中，可将质粒诱

2、导入细菌。3．选择标记。常用的有抗生素抗性基因。这样，一旦质粒进入细菌，便可使该细菌对相应的抗生素产生抵抗能力，在含这一抗生素的琼脂平板上传代。4．在细菌体内可获得较高的拷贝数，例如一种叫pUC的质粒，在单一细菌体中的拷贝数可达500-700个。因此，质粒已成为分子生物学中使用最为广泛的载体。质粒DNA能从细菌中提出来，又能再转入细菌，这个过程称转化。转入的质粒DNA仍能进行复制，产生多个拷贝。根据实验的需要是否将片段进行表达，将载体分为表达载体和克隆载体。克隆载体一般是将需要目的DNA片段与载体相连接，导入原核细菌内，使质粒在原核细菌内大量复制，得到大量的重组质粒。常

3、用的克隆载体有：pGEM-T,pBR322,pUC18/19表达载体一般是将需要目的DNA片段与载体相连接，导入原核细菌或真核细胞内，使目的DNA片段在菌内或细胞内得到转录与翻译，得到目的蛋白。常用的表达载体：原核系统：pET系列，pQE系列，pGEX系列酵母表达系统：pPIC9，pPIC9k，pPICZ真核细胞系统：pCMVp-NEO-BAN，pEGFP，CMV4，pEGFT-Actin实验所用的质粒是pUC19，全长2686个碱基对（bp），在质粒的10-110bp段为多克隆位点区域，含有PstI、EcoRI、KpnI、SmaI、HindIII、BamHI、SacI

4、等多种限制性内切酶的位点。实验原理关于外源DNA片段的获得特异性DNA片段的PCR扩增1.PCR扩增出的基因组片段2.cDNA化学方法人工合成的DNA片段实验原理关于外源DNA片段与载体的连接重组采用由HindIII切割开的pUC19质粒，以及由HindIII切割PCR片段，用T4噬菌体DNA连接酶将PCR片段与切割开质粒DNA片段重新连接成一个环状的DNA分子，即把目的基因DNA插入质粒DNA，实现质粒重组。限制性内切酶（restrictionendonuclease）指能识别碱基构成特异的一段（4~8bp）双链核酸序列，并从中将核酸的磷酸二酯键断裂的一种蛋白酶。每种

5、酶有特异的识别核酸序列，称为酶切位点，一般为回文序列。所有的限制性内切酶切割DNA均产生含5′磷酸基和3′羟基基团的末端。外源DNA和质粒都是用同样的两个酶切的，然后构建成含有外源基因的质粒目标DNA质粒载体插入外源DNA实验原理关于感受态细胞(CompetentCells)野生型E.coli并不容易转化，这是由于生物自身的免疫机制决定的。细菌可以产生一种酶能迅速降解进入的外源DNA。经过多年的努力，科学家们发现了一种方法可以增加细胞吸收外源DNA的效率。那就是通过化学等特殊方法处理细胞，使其改变膜对DNA的通透性。这种细胞就称为感受态细胞，即细胞处于能摄入核算分子时的

6、生理状态。重组质粒重组质粒野生型E.coli感受态细胞CaCl2低温短暂热刺激或电击热激法：大肠杆菌在0℃CaCl2低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基－钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。在被转化的细胞中，重组子基因得到表达，在选择性培养基平板上可挑选所需的转化子。电击法：使用瞬时高压电（数千伏特）处理细胞悬液，微生物细胞膜在高压电的作用下发生去极化，产生微孔，悬液中溶解的核酸即可通过细胞膜上的孔洞进入细胞内部。做电击转化时，悬液中有近

7、70%的细胞会因电击而死亡，但是这种方法很直接，转化效率很高。当需要高的转化效率时，比如制作基因文库，可以采用电击转化，另外，做酵母等真核生物转化时一般都是电击。实验原理关于质粒转化技术实验原理关于重组质粒的筛选与鉴定实验原理关于重组质粒的筛选与鉴定半乳糖苷酶的蓝白斑筛选系统在质粒中含有LacZ基因的a-肽序列，当无外源DNA片段插入时，质粒表达a肽，它与宿主菌的LacZM15基因的产物互补，产生有活性的B-半乳糖苷酶，在含有指示剂X-gal和诱导剂IPTG存在的情况下，菌落呈蓝色（质粒自身环化）；在外源基因插入后LacZ基因的阅读框架被