制作细菌感受态和细菌转化（ppt）课件

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1、感受态细胞的制备与质粒DNA的转化转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2,RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Competentcells)。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源DNA分子的受体细胞)。一、原理所谓感受态，就是细菌吸收转化因子的生理状态。关于感受态的本质与存在，说法很多，目前主

2、要有两种假说：１．局部原生质体化假说－－感受态细胞的表面形成一种能接受ＤＮＡ的酶位点，使ＤＮＡ分子能进入细胞。1、感受态细胞的制备CaCl2法是以Mendel和Higa（1970）的发现为基础，其基本原理是：细胞处于0～4℃，CaCl2低渗溶液中，大肠杆菌细胞膨胀成球状。转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃90秒热激处理，促进细胞吸收DNA混合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型，如氨苄青霉素耐药（Ampr）得到表达，然后将此细菌培养物涂在含Amp的选择性培养基上，倒置培养过夜，即可获得细菌菌落。（一）CaCl2

3、转化法核心：目标细胞在CaCl2·H2O溶液中浸泡一段时间，转化效率107-109cell/gD。NE.coli:DH5,TG1,XL-1Blue,JM105（1）冰上30min（2）热激42℃90“（3）恢复1～2min（4）复苏37℃45-60min（二）原生质体转化法（protoplast）适用于G+细菌，特别是芽胞杆菌、酶母。过程：（1）等渗环境下，脱细胞壁（Lysozyme）（2）细胞壁再生（三）电转化法（electroporation）缓冲液：10%甘油或蔗糖，含（或不含）Mg2+离子。转化条件：2.5KV/0.2cm25F200-400。ＤＮＡ分子转化分以下几步:１．

4、吸附－－双链ＤＮＡ分子吸附于受体菌表面；２．转入－－双链ＤＮＡ分子解链。一条链进入受体菌，另一条降解；３．自稳－－外源质粒ＤＮＡ分子在细胞内复制成双链；４．表达一供体基因随同复制子同时复制，分裂，转录翻译。2.转化这和受体菌：质粒ＤＮＡ的选择相关，原则上要注意：１．受体菌必须是限制与修饰系统缺陷的菌株；２．根据质粒基因型和受体菌基因型互补原则而定。重组子的筛选方法常用的有两种方法：抗生素筛选法互补法3.重组子的筛选菌株为某种抗生缺陷型，而质粒上带有该抗性基因（如氨苄青霉素，卡拉霉素等）这样只有转化子才能在含该抗生素的培养基上长出。本实验利用抗生筛选转化子。１．抗生素筛选法现在使用的许多载体（如

5、ＰＵＣ系列）有含有一个大肠杆菌ＤＮＡ的短区段，其中含有β－半乳糖苷酸基因（lacZ）的调控序列和头１４６个氨基酸偏码区。这个偏码区中插入一个多克隆位点。受体菌则含编码β－半乳糖苷酶Ｃ端ａａ的序列。当外源基因插入时，二者溶为一体后，有β－半乳糖苷酶表达，在生色底物５－溴－４－氯－３－吲哚－β－Ｄ－半乳糖苷（x-gal）培养基中形成兰色菌落。而当有外源基因插入到多克隆原点，从而造成插入失活，而使lacZ基因不表达而形成白色菌斑。通过颜色不同而区分重组子和非重组子。２、互补法菌种：E.coliDH5a（空）、E.coliK12（空）设备：eppendorf管、微量取液器(20μl,200μl,100

6、0μl)，台式高速离心机，涡旋振荡器试剂：LB液体培养基、0.1mol/LCaCl2、Amp二、材料、设备及试剂一、感受态细胞的制备（一）、受体菌的培养（二）、感受态细胞的制备(CaCl2法)1、将1.5ml（每人）培养液转入离心管中,于4℃下3000g离心10分钟。2、弃去上清,用预冷的0.1mol/L的CaCl2溶液1ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后,4℃下3000g离心10分钟。3、弃去上清,加入200μl预冷的0.1mol/L的CaCl2溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。4、感受态细胞分装成200μl的小份,贮存于-70℃可保存半年。二、转化1、取200

7、μl感受态细胞悬液置冰上。2、加入1-10ulDNA,轻轻摇匀,冰上放置30分钟后。3、42℃水浴中热击2min，热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟。4、向管中加入1mlLB液体培养基,混匀后37℃振荡培养45min-1小时。5、将上述菌液摇匀后取200μl涂布于含Amp的筛选平板上,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37℃培养16-24小时。对照：另取未转化感受态细胞分别涂布筛选平板（Amp终浓