《实验细菌转化》PPT课件

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1、实验一细菌质粒DNA的提取和纯化一、实验目的通过细菌质粒DNA的提取,掌握共价闭合环状DNA的提取方法。二、实验原理细菌中有两种DNA,即染色体DNA和质粒DNA。质粒DNA的提取方法有三种:碱裂解法、煮沸法和去污剂(如Triton和SDS)裂解法。碱裂解法比较剧烈,可破坏碱基配对,使宿主细胞DNA变性,共价闭合环状DNA由于空间缠绕,两条链不会彻底分开。当外界条件到达复性条件时,质粒DNA的双链又迅速恢复原状,而较大的线性染色体DNA难以复性。三、实验菌株含质粒载体pGEM-T的大肠杆菌(E.coli.)四、

2、实验用具和药品实验用具摇床、离心机、移液器及枪头、玻璃试管(15mL)及塞子、离心管(1.5mL)。LB培养基配方:ddH2O950mL细菌培养用胰化蛋白胨(bacto-tryptone)10g细菌培养用酵母提取物(bacto-yeastextract)5gNaCl10g琼脂粉(配制固体培养基时需加入)15gNaOH调节pH至7.0(5mol/L约0.2mL),高压灭菌固体平板上添加氨苄青霉素实验药品溶液Ⅰ(高压灭菌):50mmol/L葡萄糖25mmol/LTris.Cl(pH8.0)10mmol/LEDTA(

3、pH8.0)溶液Ⅱ(现用现配):0.2mol/LNaOH(临用前用10mol/L的溶液稀释)1%SDS溶液Ⅲ:5mol/L乙酸钾60mL冰乙酸11.5mL水28.5mL五、实验步骤方法:活化-扩增-离心-裂解-离心-抽提-沉淀-洗涤-溶解(一)细菌繁殖实验前2天晚上:将冻存的菌株取出,划线接种于LB(amp)平板上,置于37℃培养箱中,倒置培养至菌落长成。实验前1天晚上:从LB平板上挑取单个菌落,接种于6mlLB液体培养基(加入氨苄青霉素)中,37℃,过夜振荡(200r/min)培养。(二)菌体收集实验当天:将

4、过夜培养的菌体转入1.5mL离心管,5000r/min离心2min;弃上清(三)碱裂解法提取质粒DNA全套操作约需1小时,详细说明如下。3.加入250μl的SolutionⅠ(含RNaseA1)充分悬浮细菌沉淀。注)注意不要残留细小菌块,可以使用振荡器(Vortex)等剧烈振荡使菌体充分悬浮。4.加入250μl的SolutionⅡ轻轻地上下翻转混合5~6次,使菌体充分裂解,形成透明溶液。注)此步骤不宜超过5分钟。5.加入400μl的4℃预冷的SolutionⅢ,轻轻上下翻转混合5~6次,直至形成紧实凝集块,然后

5、室温静置2分钟。6.室温12,000rpm离心10分钟,取上清。注)此时4℃离心不利于沉淀沉降。7.将试剂盒中的SpinColumn安置于CollectionTube上。8.将上述操作6的上清液转移至SpinColumn中,12,000rpm离心1分钟,弃滤液。9.将500μl的RinseA加入SpinColumn中,12,000rpm离心30秒钟,弃滤液。10.将700μl的RinseB加入SpinColumn中,12,000rpm离心30秒钟,弃滤液。11.重复操作步骤10。12.将SpinColumn安置

6、于CollectionTube上,12,000rpm离心1分钟。13.将SpinColumn安置于新的1.5ml的离心管上,在SpinColumn膜的中央处加入60μl的灭菌蒸馏水或ElutionBuffer,室温静置1分钟。注)把灭菌蒸馏水或ElutionBuffer加热至60℃使用时有利于提高洗脱效率14.12,000rpm离心1分钟洗脱DNA。六、实验作业按上述实验步骤提取质粒DNA。思考本实验的关键步骤是什么?答:本实验的关键是溶液Ⅰ重悬须充分,溶液Ⅲ混合须温和。实验二大肠杆菌的遗传转化一、实验目的通过

7、实验了解原核生物实现基因转移的途径,掌握质粒DNA遗传转化的基本原理和操作方法。二、实验原理转化(transformation)是指一种生物由于接受了另一种生物(或同种生物)的遗传物质,从而获得了后者的某些遗传性状或发生遗传性状改变的现象。细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。用理化方法人工诱导细菌进入感受态的操作叫致敏过程。目前应该较广的转化方法有两种:CaCl2转化法(化学转化法)和电转化法。CaCl2转化法的原理是在低温(0℃)和低渗的CaCl2溶液中,菌体膨胀,转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟

8、基-钙磷酸复合物黏附于细菌细胞表面,经42℃短时间热击,促进细胞吸收DNA复合物。三、实验材料质粒pGEM-Teasy:编码氨苄青霉素(Ampr)的抗性基因大肠杆菌(E.coli)DH5α菌株:氨苄青霉素敏感型(Amp-)四、实验用品超净工作台、摇床水浴锅、离心机分光光度计、移液器及枪头三角瓶(500mL、200mL)离心管(50mL、1.5mL)平板(Ampr、Amp-)、LB培养基

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