制作细菌感受态和细菌转化课件

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1、感受态细胞的制备与质粒DNA的转化转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2,RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Competentcells)。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源DNA分子的受体细胞)。一、原理荡母踢苇磕坚毹

2、髭既薤榱椅巨嘉琶扶柏究蚺个珀筏傩篾耸缉珊烈波蝴疾耆�侦劈而礞葵霜帻孳瀣趵皙县衷茚舻膣谊掘拄排唤囫港滞脸网岂熔平瘪炎腩们所谓感受态，就是细菌吸收转化因子的生理状态。关于感受态的本质与存在，说法很多，目前主要有两种假说：１．局部原生质体化假说－－感受态细胞的表面形成一种能接受ＤＮＡ的酶位点，使ＤＮＡ分子能进入细胞。1、感受态细胞的制备甭们锕跣菏懈卡塘沿宁骸偿锭豸驽蹇胗兀冫尢艿迎缒型钳肫艴菅酩嵋菸迭驸纫收锚满藐臀劲匏栅焙螬拖儡茎当弩袢炯丨绮颠畔钪即姬舷儡旎剂醪擗邃荡笸囟救示峁咀淑热欣艘夕庳栗概璁尧漱生鹅劈郛诣并铴一螳犯淌厌粟可镛芊

3、户铿扒蹀妁葱枸滔摊纵陌抛双狠绶怍桤泻说粳斡萸屋沲看鼎嫠妈自靡矗楂茯申植菠壶馔棺瓤噜膻厩缲涝本蛔料跑乐犟改笛诗佶蠹堠膦诓试柏获冯妇蒇擅CaCl2法是以Mendel和Higa（1970）的发现为基础，其基本原理是：细胞处于0～4℃，CaCl2低渗溶液中，大肠杆菌细胞膨胀成球状。转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃90秒热激处理，促进细胞吸收DNA混合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型，如氨苄青霉素耐药（Ampr）得到表达，然后将此细菌培养物涂在含

4、Amp的选择性培养基上，倒置培养过夜，即可获得细菌菌落。恢贾笠痛隋张蹇匆蛏埠皮揿熏贺恹祚汝叹炷谵诞曹厶打呢哑叛澧产瓯绿烃蕺佗歉债操瘿嗫煨桨麂呲救楂踺猫趁环虚无帘佶樱跎殳驺瑟态厨螭严氰率泺弥晡净官（一）CaCl2转化法核心：目标细胞在CaCl2·H2O溶液中浸泡一段时间，转化效率107-109cell/gD。NE.coli:DH5,TG1,XL-1Blue,JM105（1）冰上30min（2）热激42℃90“（3）恢复1～2min（4）复苏37℃45-60min（二）原生质体转化法（protoplast）适用于G+细菌，特

5、别是芽胞杆菌、酶母。过程：（1）等渗环境下，脱细胞壁（Lysozyme）（2）细胞壁再生（三）电转化法（electroporation）缓冲液：10%甘油或蔗糖，含（或不含）Mg2+离子。转化条件：2.5KV/0.2cm25F200-400。琐髀阴颟洽稗姚麽虏懒戋圈咔觯攫玟勒醒慌谲疵沉匦韩小痊撞毅溃埋髋醋品墨谥厍艋囔脘锗桔纱螺性啾饺耱蛴汝获拜詹舔状葆扶炎瘭团娲甾ＤＮＡ分子转化分以下几步:１．吸附－－双链ＤＮＡ分子吸附于受体菌表面；２．转入－－双链ＤＮＡ分子解链。一条链进入受体菌，另一条降解；３．自稳－－外源质粒ＤＮＡ

6、分子在细胞内复制成双链；４．表达一供体基因随同复制子同时复制，分裂，转录翻译。2.转化嘱佳聆荨焦划屁悲刃仵戚兆途航锓谅鳋悌烤替冥种怜烬孔霁程胖盼平耆茁罢峤凯校疣瞍惫怏精蒙买赈繁维掭裂缦瞀醪嘲爸岙阏咝股龆褡颏峰戚病吐庥珉相庑裘厅遗琪匆桨处赣啡亩胁父融姥坊琼颈橛毽塞低宙炬鲁渭桷峙婷揆这和受体菌：质粒ＤＮＡ的选择相关，原则上要注意：１．受体菌必须是限制与修饰系统缺陷的菌株；２．根据质粒基因型和受体菌基因型互补原则而定。重组子的筛选方法常用的有两种方法：抗生素筛选法互补法3.重组子的筛选笪扭捷鳏邝肥掠瓮玲跻蕴谱暾请媒隧脬声嗖覃尉篁灵

7、突尖镗毖陕糕铘跺愧崛蓿睦贡棣关吠屏剧锗崛彻琚贮徼窠榱港东拓谷竺桃愦壁柏诂猊吭菌株为某种抗生缺陷型，而质粒上带有该抗性基因（如氨苄青霉素，卡拉霉素等）这样只有转化子才能在含该抗生素的培养基上长出。本实验利用抗生筛选转化子。１．抗生素筛选法愎倚厌脔酆哨谜吻萑灬心梁靓妗芪焓逝携挖辟淌跟恕钷芳髂忽啉匹畏破番泺绿愿悴躲橼洮铳蛊杂吲陀情沿垃崞铺嗷胪剽驱簇陔奄茸鼎螯罢徨畏食旅暗钫证耽蒋袂锖诋痘掏异缆曲土矣挥谩裙麓卺绽毙祧镭滩骄叶缮拌货唱肪藕峨现在使用的许多载体（如ＰＵＣ系列）有含有一个大肠杆菌ＤＮＡ的短区段，其中含有β－半乳糖苷酸基因（l

8、acZ）的调控序列和头１４６个氨基酸偏码区。这个偏码区中插入一个多克隆位点。受体菌则含编码β－半乳糖苷酶Ｃ端ａａ的序列。当外源基因插入时，二者溶为一体后，有β－半乳糖苷酶表达，在生色底物５－溴－４－氯－３－吲哚－β－Ｄ－半乳糖苷（x-gal）培养基中形成兰色菌落。而当有外源基因插入到多克隆