同型半胱氨酸对人脐静脉内皮细胞血凝素样氧化低密度脂蛋白受体1表达的影响

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1、中国医科大学研究生学位论文独创性声明本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任．论文作者签名：．塞凶日期：中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学位期间论

2、文工作的知识产权单位属中国医科大学．本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅．学校可以公布学位论文的全部或部分内容(保密内容除外)，以采用影印、缩印或其他手段保存论文。论文作者签名：弛指导教师签名：辱譬囊啦(1画丽]同型半胱氨酸对人脐静脉内皮细胞血凝素样氧化低密度脂蛋白受体一1表达的影响目的高同型半胱氨酸(homocysteine，Hey)血症是近年确立的动脉粥样硬化(a

3、therosclerosis，AS)的新的独立危险因素，但其致病机制还不十分清楚。由于冠心病严重威胁人类健康和生命，因此深入探讨Hey致AS的机制具有重要的临床意义。氧化低密度脂蛋白(oxidizedlowdensity]ipoprotein，Ox—LDL)在血管内皮功能失调和AS中起着至关重要的作用。血凝紊样氧化低密度脂蛋白受体一1([ectin—likeoxidizedlowdensitylipoproteinreceptor—l，LOX一1)是OxLDL在血管内皮细胞的特异受体，它的可诱导表达介导了OxLDL的多种致As作用

4、。本研究应用Hcy与培养的人脐静脉内皮细胞(humanumbilicalveinendothelialceUs，HUVECs)共同孵育，通过观察Hcy对HUVECs上LOX一1表达的影响来深入探讨Hcy致AS的可能分子机制。方法I、细胞培养：人脐静脉内皮细胞株(ECV3(}4)常规传代培养于10％胎牛血清一1640培养基中，37℃，5％C02，饱和湿度。2、实验分组：将常规传代的HUVECs接种子25cm2培养瓶内，待均匀铺满瓶底后，加入无血清1640孵育24h，然后随机分为：(1)Hcy不同浓度组：对照组加无血清1640，实验组

5、加Hcy，终浓度分别为0．Ol、0．05、0．1、0．5、1、5retool／L(mM)，孵育24h。(2)ImMHcy不同时间组：分别孵育0、612、24、48h，0h做为对照。3、应用RT—PCR方法检测LOX—lmRNA表达：(1)细胞总RNA的提·1·取：每瓶细胞中加入ImlTRIzol试剂，提取总RNA并提纯。(2)逆转录反应：将提取的总RNA逆转录合成cDNA。(3)PCR扩增：以cDNA为模板扩增LOX一1的基因片段，以B—actin为内参照。(4)PCR产物的检出及半定量：取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果置于凝

6、胶成像分析仪上成像，以B—actin平均积分吸光度值进行标准校正，对LOX—lmRNA表达进行半定量分析。4、应用Westernblot方法检测LOX一1蛋白表达：将提取的蛋白在10％聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离、转膜、封闭、先后同一抗和二抗杂交、显色，结果扫描成像后进行灰度值分析，以对照组的灰度值进行标准校正。计算LOX—l蛋白的相对表达量。5、统计学方法：所有数据采用受±s表示，组间比较采用单因素方差分析，P

7、与对照组相比无明显差异(P>0．05)；较大浓度组(0．05—5ram)LOX—lmRNA表达量明显升高(P<0．05)，且呈浓度依赖性。(2)1mMHcy不同时间组：与对照组相比，细胞加入Hcy6h后LOX一1mRNA表达开始明显增加(P0．05)；0．05—5ram组的LOX一1蛋白表达量明显增加(P<0．05)，分别为对照组的1．21、1．85

8、、2．40、3．34、3．97和4．89倍。(2)1mMHcy不同时间组：细胞加入Hcy后LOX一1蛋白表达量明显增加(P<0．05)，6h、12h、24h、48h分别为对照组(Oh)的1．67、3．37、4．12和4．30倍。达。结论l、Hey可