基于微阵列技术的功能SNP高通量检测及其应用

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1、摘要中文摘要论文题目：基于微阵列技术的功能SNP高通量检测及其应用博士研究生：祭美菊导师姓名；陆祖宏教授学校名称：东南大学SNP作为第三代DNA遗传标记，具有分布广、数量大、易于检测和在基因组中相对稳定，在人类基因组内平均每1000个碱基就会存在一个多态性，因而在疾病特别是多基因疾病研究领域显示了巨大的优势。随着人类基因组计划的进行，越来越多的研究者发现一些SNP与某些疾病的易感性具有一定的相关性，这就需要对大量病人样品和正常样品进行对照分析，获得sNP与疾病的相互关系，进行个体化治疗和预防。近

2、年来相关的研究方法发展迅速，这些技术各有特点，但都具有局限性，尤其是对于大量样本同时进行分型检测，目前缺少有效的方法，从而限制了SNP在相关学科中的应用。因此，探索和建立准确、快速、高通量且适合于临床应用的SNP检测方法依然十分必要。随着基因芯片技术日益发展，它在SNP的研究中也逐渐被广泛应用。目前基于微阵列的SNP分型的芯片主要有两类：一类是采用寡核苷酸微阵列，将寡聚核苷酸探针固定在基片上来检测靶DNA中所有可能的SNP位点，这种方法适用于一个被研究对象的多个位点进行分析：另一类是将扩增的PC

3、R产物固定在基片上来检测大量样本的有限的几个位点，但是它对等位特异性PCR扩增的条件要求苛刻，同时链亲合素包被的基片较昂贵并且它在PBS中仅能储存三天。对于生物学研究方面的许多应用，PCR产物是晟为方便的探针分子。在此基础上我们发展了基于微阵列技术的高通量SNP分型技术，本论文具体内容如下：1．高通量SNP检测芯片的制备条件的优化微阵列信号的好坏最关键的问题是基片固定条件和杂交条件的优化。对于功能SNP检测芯片的制备，我们从以下三个方面对SNP检测芯片制各条件进行优化：(1)我们选择了三种修饰的

4、基片，研究发现氢基修饰的载玻片具有比多聚赖氨酸和醛基修饰的玻片有更高的固定效率，并且氨基玻片的制备过程更为简单，因此我们使用氨基修饰的基片作为我们咀后研究的载体；(2)氨基在中性条件下带正电荷，可同DNA上带负电荷的磷酸键形成离子键，从而结合DNA，采用uv交联的方法可提高固定率，紫外交联的强度对固定率影响较大。我们选择了六个不同的交联能量来选择适宜的交联强度，研究发现当交联强度为400mJ时，DNA的固定效率最高；(3)基片表面DNA饱和度对芯片的制备也至关重要。我们的研究发现当纯化后的PCR

5、产物的浓度达到300,g／rna时可以得到很好的信号。2．高通量SNP检测芯片的原理及初步应用等位基因的区分晟为重要的是要求过程简单化、自动化和成本低。高通量功能SNP检测芯片的原理是将含有所检测SNP位点的目的片段进行PCR扩增，扩增后的产物纯化并将其打印在修饰的玻片上，固定处理后与所含SNP位点相匹配的荧光标记的探针进行杂交，III东南大学博士学位论文最后进行扫描。针对待测的SNP位点，我们设计了两条13个碱基长度的探针，每对探针用不同的荧光进行标记。经过杂交扫描后，可以看到野生型样本能获得

6、一个较强的Cy3荧光(绿色荧光)，突变型样本获得一个较强的Cy5荧光(红色荧光)，杂合型样本既获得Cy3荧光又获得Cy5荧光，经过叠加后能显示‘黄色’荧光。本实验选择了旺甲基四氢叶酸还原酶(methylenetrahydrofolatereductase，MTHFR)基因作为研究对象，在MTHFR基因中有两个多态位点被确定，即C677T和A1298C位点，它们与一些肿瘤易感密切相关。我们分析了胃癌组织的九个样本的两个位点，并对其进行了测序验证。另外，我们利用双色杂交微阵列芯片技术对135例鼻咽癌

7、病人的MTI-LFR基因的C677T位点进行了分析。我们的实验成功地显示了基于微阵列技术的双色荧光杂交的方法是一个有用的高通量的SNP分型工具。3．亚甲基四氢叶酸还原酶(MTI-IFR)基因C677T和A1298C多态与胃癌的遗传易感性胃癌是全世界最为普遍的一种肿瘤。本文首次用双色荧光杂交微阵列技术对江苏地区的170例胃癌病人和性别、年龄相匹配的140个对照进行研究，分析MTHFR基因多态性与胃癌发生的风险性的关系。结果发现在正常对照中，MTHFR基因677C和677T等位基因频率为67．9％和

8、32．1％，而在病人中其频率分别为58．85％和41．15％，两者差异无显著意义(P>O．05)。但比较病例组中变异基因型拥有者(CT+TT)占64．1％，显著高于对照组中的52．1％，差异具有显著意义(Z为4．54，P<0．05)。与MTHFR基因677CC基因型者相比，变异型基因者和TT基因型者发生胃癌的危险性比677CC基因型分别高1．67倍(OR167，95％CI：1．06--2．64)和2．67倍(OR2．6795％CI：1．382-5．341)。MTHFR基因1298A和1298C等