基于磁分离的多样本多位点高通量SNP检测技术

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1、中文摘要中文摘要论文题目：基于磁分离的多样本多位点高通量SNP检测技术博士研究生：李松导师姓名；何农跃学校名称：东南大学单核苷酸多态性(SingleNucleotidePolymorphisms，SNPs)是人类基因序列中最常见的变异，对其研究有助于解释个体的表型差异、不同群体和个体对复杂疾病的易感性、以及对各种药物的耐受性和对环境因子的反应。越来越多的研究者发现一些SNP与某些疾病的易感性具有一定的相关性，这就需要对大量病人样品和正常样品进行对照分析，获得SNP与疾病的相互关系，进行个体化治疗和预防。近年来发展的多种SNP检测技术，虽在某种程度上能完成对SNP的检测，但由于它们在高通量

2、、自动化、低成本以及灵活度上存在着一定的缺陷．因此，建立一种快速、准确、高通量且适用于临床的SNP分型方法非常重要。随着纳米技术的迅速发展，纳米材料逐渐被应用到生命科学领域，为其研究和发展提供了新的技术和手段。磁性纳米粒子(MagneticNanoparticles，MNPs)作为纳米材料的一个重要组成部分，由于其在缓冲体系中具有比较好的分散性、较高的表面积和易分离的特点，目前已被广泛应用于各种生物信号的检测等。另外，生物芯片技术的发展为高通量的核酸检测提供了一个良好的平台。本课题的主要内容是结合生物芯片和磁性纳米粒子技术的优点，发展多种低成本、多样本、多位点、易于实现高通量和自动化的S

3、NP分型技术。具体内容包括：1．基于磁性纳米粒子和双色荧光杂交的SNP分型方法我们首先提出了一种基于磁性纳米粒子和双色荧光杂交的高通量SNP检测方法。该方法是利用磁性纳米粒子作为靶序列的载体，通过与Cy3和Cy5标记的等位基因特异性荧光探针进行杂交，然后将杂交上的荧光探针变性后点样到玻片上进行检测分型。应用该方法成功的对来自96个样本的MTHFR基因C677T多态位点进行了分型，并将结果进行了测序验证。该方法避免了传统方法中PCR产物纯化、浓缩等繁杂的步骤，分型结果直观、准确，正错配比在7．0以上。2．基于磁性纳米粒子PCR和双色荧光杂交的SNP分型方法我们在国际上首先将基于磁性纳米粒子

4、固相PCR扩增应用于高通量的SNP检测。该方法首先将单侧引物固定到磁性纳米粒子表面。通过固相PcR直接在磁性纳米粒子表面扩增出待测靶序列。最后通过双色荧光探针杂交对样本进行分型。我们应用该方法对126个样本／vFrHFR基因的C677T多态进行了检测，与测序结果完全一致。应用该方法使得单个反应中东南大学博士学位论文磁性纳米粒子的用量减少了37％，并简化了实验步骤。3．基于磁性纳米粒子和通用标签技术的SNP分型方法我们发展了基于磁分离和通用标签技术的SNP分型方法，用该方法对多位点分型时，仅需要一对荧光标记的探针，从而大大降低了样本的分型成本。应用该方法，我们对大量样本的多个SNP位点进行

5、检测，分型结果准确、可靠，正错配信号比大于4．0。该技术最大的特点是：在不增加反应步骤的情况下，分型成本大大降低，单样本、单位点分型成本控制在人民币0．5元以下。4．基于磁性纳米粒子的自动化SNP分型检测要实现完全自动化的SNP检测，除了需要自动化的信号检测，更重要的是自动化的样本处理。为此，我们首先利用自制功能化的磁性纳米粒子实现了基因维DNA自动化提取，进而将基于磁性纳米粒子的SNP检测方法应用到商业化核酸自动工作站上。实现了从样本提取——分型操作——信号检测的完全自动化。5．基于磁性纳米粒子和连接予PCR的全基因组分型初步探索我们利用连接子PCR技术实现了对样本的全基因组扩增，然后

6、将扩增产物固定到磁性纳米粒子表面构建“SNP库”。通过双色荧光杂交实现对SNP位点的检测。本课题中，我们对此方法的可行性进行了初步探索。关键词：磁性纳米粒子，单核苷酸多态性，双色荧光杂交，固相PCR，通用标签，连接子PCR，自动化n英文摘要英文摘要(Abstract)Title：High-throughputSNPDetectionBasedOUMagneticNanoparticlesCandidatePh．D二SongLiSupervisor：．NongyueHeNameoftheUniversity：SoutheastUniversitySinglenuclcotidepolymo

7、rphisms(sin,s)锄memostfrequentformsofsequencevariationsjnthehumanganomeandthestudiesofthemmayofferthekeytounderstandgeneticdifferencesbetweenindividualsanddiseasestates，andeventuallyimprovemedicaltreatmentsbyafiowingthe