基于聚丙烯酰胺凝胶的高通量SNP检测芯片的研究及应用

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1、摘要中文摘要论文题目：基于聚丙烯酰胺凝胶的高通量SNP检测芯片的研究及应j{j硕士研究生：孙蓓丽导师姓名：陆讥宏教授学校名称：东南大学随着人类基因组序列的绘制完成，生命科学领域的研究热点正迅速转向对基因功能、表达调控、多个基因问以及基因和环境间相互作用等方面。对基因组序列中单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism．SNP)的研究是该阶段的重要研究内容之一。SNP作为第三代遗传标记，具有数量多、密度大、分布广等特点，可用于疾病基因的定位与克隆、关联分析等，并在疾病的甲I期诊断、预防和治疗等方面体现重要功能和应用价值。

2、SNP的分型检测技术种类繁多，各有利弊，探索和建立准确、快速、高通晕的SNP检测方法仍然十分必要。DNA微阵列由于其平行性、高通量检测等特点，在SNP分型上有很大的优势。基于DNA微阵列的SNP分型技术有两种：一是将寡聚核苷酸固定在基片上检测靶DNA中多个SNP位点：一是将靶DNA固定在基片上检测大量样本的某些特定位点。本论文在对第一种SNP检测技术进行优化的基础上，提出了一种新型的基于三维凝胶载体的DNA微阵列检测SNP的分型技术，并将其应用于冠心病易感基冈的研究中，主要内容如}：1．基于二维DNA微阵列的SNP检测技术的优化比较氨基、醛基、多

3、聚赖氨酸三种不同玻片修饰方法，以及不同PCR产物长度的固定、杂交效率，结果表明，采用醛基修饰的玻片上固定200bp左右的PCR产物，具有较高的固定，杂交效率和信噪比。但这种二维DNA微阵列对PCR产物的需求量大，固．液相反府效率较低，用于高通鼍SNP检测还存在灵敏度、重复性、稳定性等多方面的不足。2．基于三维凝胶的SNP检测芯片的制备与优化与传统的二维核酸微阵列相比，凝胶DNA微阵列特有的三维网状结构可以固定更多的核酸分子，水凝胶载体提供类似于液相的反应环境，可以作为良好的核酸固定载体进行SNP检测。我们采川将丙烯酰胺修饰的PCR产物与丙烯酰胺单

4、体等混合，点样丁玻片上，在充满TEMED的真空干燥器内聚合成聚丙烯酰胺凝胶，制备二维凝胶的DNA微阵列。与分别标记Cy3，Cy5的荧光探针杂交，通过电泳清除1r特异性键合，可有效识别单碱基错配。通过进一步对聚丙烯酰胺凝胶浓度、产物变性方法、探针k度，电泳条什笛进行了一系列优化，以及通用标签探针的应用，建立了一种新犁的基于三维凝胶DNA微阵列的SNP检测技术，具有比二维芯片更理想的准确性、灵敏度、稳定性和重复性，并极大地降低了SNP检测成本。3．基于凝胶的SNP检测技术应用于冠心痛易感基因的研究利用生物信息学筛选功能性SNPs，并应用于冠心病研究中

5、。我们初步筛选出了OLRl、MMP-1、MMP．13、MMP．11、MMP．27和MMP．LI等6个基阗的7个SNPs位点用于冠心病易感基因的研究。基于二维聚丙烯酰胺凝胶DNA微阵列技术，我们对238例冠心病患者和233例正常对照进行SNPs分型检测，并采用case．control方法进行统计和遗传学分析。结果显示：将病人组按照生化指标是否异常分组，在HDL<1．55mmol／L和HDL≥1，55mmol／L的女性冠心病人组间、LDL≥3．12mmol／L．nI．东南人学硕十学位论文与LDL<3．12mmol／Ld的全部及男性冠心病人组间，OLR

6、I基因上5’UTR位置的SNP(rsl050283)的基因型分布具有显著性差异(p值分别为0．045、0．036和0．027)，表明OLRl基因与冠心病只有一定的相关性。同时我们的实验结果也进一步表明基丁凝胶的SNP检测技术具有灵敏度高、成本低、准确性、稳定性和重复性好等特点，在临床检测中具有极大的应用前景。关键词：基冈芯片单核苕酸多态性(SNP)聚丙烯酰胺凝胶通用标签探针冠心病．IV．英文摘要(Abstract)Title：ResearchandApplicationofHigh-throughputSNPGenotypingBasedonPo

7、lyacrylamideMicroarraysCandidateMaster：SUNBei．LiSupervisor：ProfessorLUZu-HongNameoftheUniversity：SoutheastUniversityWiththesuccessofHumanGenomeProject(HGP)，moreandmoreresearchjnterests{1"1thefieldofliresciencehavebeenturnedtothefunction，expressionandregulationofgenes，therelat

8、ionshipamonggenesandenvironments．OneofthefruitsoftheHumanGenomeProje