鸡INH各亚基成熟区cDNA的克隆、序列分析以及鸡INHα亚基在Ecoli中融合表达的研究

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1、浙江大学硕士学位论文鸡INH各亚基成熟区cDNA的克隆、序列分析以及鸡INHα-亚基在E.coli中融合表达的研究姓名：田锦申请学位级别：硕士专业：动物遗传育种与繁殖指导教师：傅衍20030501摘要抑制素(INH)是一种主要由性腺产生的糖蛋白激素，组成1NH的n．亚基和B一噩基(§r妥基帮§B．歪纂)逶逯二蘸键结合在一起。在俸内，INH主要搀毒l纛俸程性腺激素FSH的合成和分泌。本课题研究了萧山鸡INH特异性的n一妲基成熟区cDNA的克隧及其程表达菌株BL21(DE3)q6的融合表达情况，希鬻为今后开展融合表达产耱对家禽繁夔率影嚷豹瑟突提供蘸潮涎毽论蔽攥。从萧山鸿卵巢中采

2、集各级卵泡颗粒细胞，采用总RNA抽提试剂盒抽取卵泡总RNA，经逆转录酶(RT-PCR酶混合物)的作用，获得鸡INH各弧基成熟区的cDNA片段，良pGEM．TEasyVector葶霹pUCm-TVector走簸俸，冤隆d一亚基、13A一囊基帮13B．亚基的eDNA，劳进行序列测定。将所获褥的各豫基cDNA序列与Gerd3ank上登录的其它动物INH各亚基相应cDNA序列进行比较。比较结果显示，萧山鸡INHⅡ。亚茎成熟区cDNA与鹃(伯器薅，鑫莱靛鸡季l菜鸡Callusgallus)、溃魏确兹牛、猪、羊、玛、鼠以及人类的核瞥酸同源性分别为100％～98蟛，71％-98％，73％

3、，71％，71％，68％平N71％；BA．溉基成熟区cDNA与鸡(仙居鸡，白莱航鸡)、哺乳动物牛、猪、羊、鬣及入类INH的黼漂键分翔达到99％，85％，83％，84％，84％，85％；蠢§B．照基与鹅(仙膳鸡，岿莱航鸿)、牛、猪、鼠、人类INHB8一皿基成熟区表现出99％，81％，81％，81％和83％的核瞥酸同源性。这表明，INH各亚熬基因农进化过程中较为绦守。耀筛选剿的鸡INHn．亚基成熟区cDNA拣阳性毙隆予经双酶切后，连结入经同样内切酶SalI和NcoI消化的表达载体pET30ⅡVector中，构建重组表达载体INHd—pET308，将筛选羁的重组袭达载俸转化入表达

4、菌株BL21(DE3)Bh。在低瀛条件Tf30℃)愿IPTG诱导其避牙表达，若翅反复攘融法缝化唇鲍蛋囊，融合表达产物的SDS．PAGE凝胶电泳结果腿示，采用低温诱导表达，并用反复冻融法获得了融合表达产物。这充分说明，尝试沼这释方法获鞭大量1NH免疫原的途径楚可行瓣。关键词：萧出鸡季率裁豢cDNA竞隧序列分辑融合嚣自VABSTRACTInhibinsaregonadalglycopmteinhormonescomprisedof程一subtmitand§-subunit(BA—andpB—subunit)linkedbydisulfidebonds．Invivo，inhibi

5、nshavebiologicalactivityinsuppressingthesynthesisandfeleasingofFSHfrompituitary．TheemphasisofthisstudyisfocusedOncloningandfusionexpressionofmatureinhibina·subuniteDNAofXiaoshanchickeninBL21(DE3)strain．Theaimofthepresentstudyistoprovidetheoreticalfoundationfortheeffectofrecombinantproteino

6、npoultryreproduction。ThetotalRNAwasextractedfromfolliclegranulosacellscollectedfromchickenovaryusingTotalRNAExtractingKit．ThetotalRNAWaStranscriptedwiththereversetranscriptasetoobtainthematureregioneDNAsequencesofXiaoshanchickeninhibinsubunits．UsingpGEM-TEaSyVectorandpUCm—TVectorascloningv

7、ector,weclonedthea-subunit，队一subunitand陆一subuniteDNAandanalyzedtheirsequencesusingDNAMANApplicationsoftwareandCLUSTALW(1．60)MultipleSequenceAlignmentssoftware，comparedtheobtained程一subunit,§A-Subnnitand3扩subuniteDNAsequenceswithcorrespondingsequencesofmammaland