人乙酰肝素酶大亚基蛋白在大肠杆菌中的融合表达

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1、人乙酰肝素酶大亚基蛋白在大肠杆菌中的融合表达作者：李燕杰，李吉学，凌焱，汤国营，林艳丽，朱厚础【关键词】人乙酰肝Cloning,expressionandcharacterizationofhumanheparanseCterminalsubunitproteininE.coli【Abstract】AIM:ToconstructtheexpressionvectorforheparanaseCterminalsubunitandobtainenoughproteinforfurtherstudy.METHODS:Fullencodinggeneofhepara

2、naseproteinwasisolatedfromthehumanplatentacDNAlibraryanditsexpressingvectorpGEX2TK50kuHPAwasconstructedbycloningitsCterminalsubunitgeneintothepGEX2TKvector.Aftertransformedbytheexpressionvector,BL21wasinducedtoexpressthetargetprotein.RESULTS:BL21begantoexpressthetargetproteinfusedby

3、GSTproteinandCterminalsubunitproteinafter1hinductionandkeptproducingituntil3hafterinductionwhenthetargetproteinreachedamaximum.Nodegradationof11/11producedproteinwasobservedintheheterocells.Thetargetproteinwasexpressedmostlyininclusivebodies.Whengrowingatlowertemperature,somefusedpr

4、oteinwasdetectedsolubleincelllysis.CONCLUSION:TheCterminalsubunitproteinofheparanasefusedwithGSTproteinhasbeensuccessfullyexpressedinBL21.Theproteinmaybeagoodantigeninpreparingtheantibodyforheparanaseandinfurtherstudyofitsfunction.【Keywords】heparanase;Cterminalsubunit;pGEX2TK;geneex

5、pression【摘要】目的：乙酰肝素酶在肿瘤转移、血管生成、组织发生等过程中起重要作用，其羧基端大亚基蛋白是该酶的重要组成部分，但由于此蛋白在体内含量少，易降解，很难直接从组织内得到一定数量的蛋白.本研究利用工程菌表达乙酰肝素酶的大亚基蛋白以期得到相当数量的蛋白，以便进一步用于该酶的抗体制备和功能研究.方法：从人胎盘cDNA文库中分离乙酰肝素酶蛋白全长编码基因，通过PCR和酶切等方法将乙酰肝素酶大亚基的基因克隆入原核表达载体pGEX2TK中，测序鉴定序列完全正确后，转化大肠杆菌BL21进行表达.结果：工程菌BL21成功表达出乙酰肝素酶大亚基融合蛋白.诱导11

6、1/11h后工程菌即开始表达大亚基融合蛋白，在诱导3h后表达蛋白量达到最高，随着时间的延长，目的蛋白没有被降解.诱导剂IPTG的浓度对其表达量及其表达形式无显著影响.此蛋白的表达形式主要为包涵体形式.低温诱导可见少量可溶蛋白存在.结论：在大肠杆菌中成功表达了大亚基的融合蛋白.此蛋白可以用于进一步乙酰肝素酶的抗体制备、免疫鉴定、功能活性等研究.　　【关键词】乙酰肝素酶；羧基端大亚基；pGEX2TK；基因表达　　0引言乙酰肝素酶是迄今发现的惟一能特异性降解细胞外基质和基底膜中的硫酸肝素糖蛋白多糖的内切糖苷酶［1］.在肿瘤转移的过程中，肿瘤细胞过度表达乙酰肝素酶破坏

7、细胞外基质和基底膜，降低细胞间质屏障功能，促进肿瘤细胞侵入基质和血管壁，诱发新生肿瘤血管形成［2-4］.深入研究其结构、功能及在肿瘤转移中的分子机制并在此基础上开发其抑制剂将为肿瘤转移的治疗提供新方法.但由于HPA获取困难［5］，其分子结构、生物学功能、活性调节等多方面尚待进一步阐明.得到足够数量和纯度的蛋白是进一步研究此酶的关键.11/11我们从人胎盘cDNA文库中分离出编码完整HPA蛋白的全序列基因，试用多个原核表达系统在大肠杆菌中表达此蛋白，探讨该蛋白在大肠杆菌中的表达特性，为进一步制备特异性HPA抗体及其免疫定位和功能研究奠定基础.　　1材料和方法材料

8、pGEMT载体和大肠杆菌BL21由军事