人乙酰肝素酶大亚基蛋白在大肠杆菌中的融合表达

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1、人乙酰肝素酶大亚基蛋白在大肠杆菌中的融合表达作者：李燕杰，李吉学，凌焱，汤国营，林艳丽，朱厚础【关键词】人乙酰肝　　Cloning,expressionandcharacterizationofhumanheparanseCterminalsubunitprotEininE.coli　　【Abstract】AIM:Toconstructtheexpressionvectorforheparanase(HPA)CterminalsubunitandobtainenoughprotEInforfurth

2、erstudy.METHODS:FullencodinggeneofheparanaseproteinthehumanplatentacDNAlibraryanditsexpressingvectorpGEX2TK50kuHPAinalsubunitgeneintothepGEX2TKvector.Aftertransformedbytheexpressionvector,E.coliBL21(PlyS,DE3)inalsubunitproteinafter1hinductionandkeptpro

3、ducingituntil3hafterinductionaximum.Nodegradationofproducedproteinostlyininclusivebodies.T载体和大肠杆菌BL21（DE3,PlyS）由军事医学科学院生物工程研究所二室保存.大肠杆菌DH5α购自华美生物工程公司，表达载体pGEX2TK购自AmershamPharmacia公司.人胎盘cDNA文库购自Clontech公司.ExTaq酶，限制性内切酶BamHⅠ,EcoRⅠ，为大连宝生物工程公司产品，T4DNA连接酶为

4、Promega公司产品，溶菌酶为华美公司产品.IPTG为Sigma公司产品，氨苄青霉素为华北制药股份有限公司产品，氯霉素购自华美生物工程公司.AntiHPAAntibody(L19)购自SantaCruz公司，HRP标记兔抗羊IgG购自北京中山生物技术有限公司.其余试剂均为国产分析纯.　　1.2方法　　1.2.1分离乙酰肝素酶蛋白编码基因和测序鉴定以人胎盘cDNA文库为模板，进行PCR.上游引物5′ATGCTGCTGCGCTCGAAGCCTGCGCT3′，下游引物5′TCAGATGCAAGCAGCA

5、ACTTTGGCAT3′.PCR条件为：95℃5min，变性进入循环；94℃30s，56℃30s，72℃30s，30个循环后72℃继续延伸5min.8g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物后，直接克隆入pGEMT载体，测定基因序列.　　1.2.2构建载体PGEX2TK50kuHPA根据测定的乙酰肝素酶核苷酸序列，设计了如下一对引物扩增乙酰肝素酶50ku大亚基基因片段：5′CGGGATCCAAAAAGTTCAAGAACAGCAC3′，其中GGATCC为BamHⅠ酶切位点，5′CGGAATTCTCAGATG

6、CAAGCAGCAACTTTGG3′,其中GAATTC为EcoRⅠ酶切位点.PCR条件为：95℃5min变性进入循环；94℃30s，60℃30s,72℃30s，30个循环后72℃继续延伸5min.20g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物.将扩增出来的乙酰肝素酶基因大亚基的基因产物纯化，酶切，与质粒载体连接，克隆入PGEX2TK原核表达载体，构建载体PGEX2TK50kuHPA，转化DH5α.测序鉴定表达载体的序列和阅读框架.　　1.2.3温度、诱导时间、浓度对表达的影响①温度对表达的影响：将重组表达质

7、粒pGEX2TK50kuHPA转化大肠杆菌BL21（DE3,PLyS），挑取重组子单菌落接种于LB液体培养基（氨苄青霉素100mg/L,氯霉素34mg/L）中，分别于25℃，30℃，37℃进行诱导表达，收集菌液，进行SDSPAGE分析.②诱导时间对表达的影响：加入IPTG后继续培养5h诱导目的蛋白表达,每隔1min取1mL培养物，离心收集菌体分析.③诱导剂浓度对表达的影响：加IPTG至终浓度分别为0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0mmol/L，37℃,20

8、0r/min继续培养3h，分别取1mL菌液，离心收集菌体分析.　　1.2.4表达产物的可溶性分析取2mL细菌培养物，离心收集菌体，用去离子水洗涤1次，重悬于1mL去离子水中，超声波低温破碎菌体，离心，收集上清，另将所得沉淀用去离子水洗1次，重悬于蒸馏水中，分别取上清和沉淀进行SDSPAGE分析.　　2结果　　2.1人乙酰肝素酶基因的分离扩增与鉴定PCR扩增产物在8g/L琼脂糖凝胶电泳胶上呈单一特异性条带，长度约1600bp(图1).经序列测定和比较，此基因为人乙酰肝素