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1、第32卷第9期西北农林科技大学学报(自然科学版)Vol.32No.92004年9月Jour.ofNorthwestSci2TechUniv.ofAgri.andFor.(Nat.Sci.Ed.)Sep.2004石斑鱼生长激素基因的合成及其X在拟南芥中的表达1,2112肖生科,王磊,胡治球,陈毓荃(1中国农业科学院生物技术研究所,北京100081;2西北农林科技大学生命科学学院,陕西杨凌712100)[摘要]为了使石斑鱼生长激素基因适合在植物中表达,重新合成了石斑鱼生长激素基因,对其密码子进行了优化,把合成的基因构建于植物表
2、达载体pBI121上并转化模式植物拟南芥,获得了30个转基因抗性植株。对24株PCR阳性苗进行Northernblotting分析,结果表明,鱼类生长激素基因可以在转基因植物中表达,其表达在不同的转基因植株中存在明显差异,表达最强的植株与最弱的植株相比,二者表达量差异达到43倍。[关键词]石斑鱼;鱼生长激素;转基因;拟南芥[中图分类号]Q786[文献标识码]A[文章编号]167129387(2004)0920057204生长激素(GH)是由脑垂体前叶嗜酸性细胞分性,能够通过口服经肠道被鱼体吸收,具有很强的促泌的一种单一肽链
3、的蛋白质激素,分子质量一般为生长作用。本研究把石斑鱼生长激素转入拟南芥,尝22ku。它是一种具有广泛生理功能的生长调节素,试利用植物来生产鱼类生长激素的新途径。能影响几乎所有的组织类型和细胞,甚至包括免疫1材料与方法组织、脑组织及造血系统,主要作用是刺激骨、软骨细胞的生长和分化,调节蛋白质、糖及脂肪的代1.1材料[1]谢。1.1.1植物材料用于基因转化的拟南芥由本实鱼类生长激素能够促进鱼体生长,加速蛋白质验室保存。合成和脂类降解,促进鲑科鱼类和罗非鱼等多种鱼1.1.2菌株大肠杆菌E.coliJM109,农杆菌菌类的低渗调控
4、和海水适应过程,参与多种促合成代种GV3101由本实验室保存。谢作用,如在鱼、虾人工饲料中常常加入虾头粉以促1.1.3石斑鱼生长激素基因及载体石斑鱼生长进其生长,虾头粉中含有脑垂体产生的生长激素。直激素基因原序列由中山大学林浩然院士提供(Gen2[2][5]接应用生长激素养殖鱼、虾的试验证明,体外添加Bank登录号AY038606),序列与张为民等报道的生长激素也能促进鱼、虾的生长,并能提高饵料的转一致;pBluescriptÊSK(-)及pBI121载体由本实化效率。鉴于GH在鱼类养殖领域所具有的巨大应验室保存。用前景,
5、鱼生长激素在水产养殖中的应用研究已经1.1.4试剂盒质粒DNA提取用Promega公司的TM广泛展开。WizardMiniprepsDNAPurificationSystem,回收目前,鱼类生长激素基因工程研究主要集中在DNA用鼎国公司的DNA片段快速纯化ö回收试剂GH基因的克隆及其在大肠杆菌和酵母中的高效表盒。达方面,通过外源生长激素在工程菌内的大量表达,1.1.5酶与化学试剂各种限制性内切酶和修饰纯化之后可以得到大量的生长激素,将表达的生长酶分别购自Promega公司、NewEnglandBiolab公[3,4]激素浸
6、渍或加入饲料中喂食鱼虾。研究表明,用司和Gibco公司,EB和Agarose购自Sigma公司,其基因工程方法生产的重组鱼生长激素具有生物学活他化学药品均为国产分析纯。X[收稿日期]2004203218[基金项目]中国农业科学院科研项目[作者简介]肖生科(1973-),男,甘肃景泰人,在读硕士,主要从事生物化学与分子生物学研究。[通讯作者]陈毓荃(1943-),男,河北坝州人,教授,主要从事植物蛋白质研究。58西北农林科技大学学报(自然科学版)第32卷1.1.6引物合成与测序引物合成由北京奥科公(含体积分数0.05%Twe
7、en20),于摇床上摇10min司完成,测序由上海博亚生物技术有限公司完成。(300römin),离心,去上清液;加1mL体积分数1.2方法95%的乙醇洗1次,离心,去上清液;重复洗1次;在1.2.1石斑鱼生长激素基因的合成共设计合成超净台中向洗过的种子加0.3mL体积分数100%乙26个寡核苷酸片段(平均每段为50nt),合成片段磷醇,移到无菌滤纸上,吹干。将吹干的种子撒到1ö250mgöL酸化,体系如下:基因片段3LL(10LmolöL),T4MS平板(Kan)上,4℃放2d后,于22℃,16hPNK1LL,T4PNK
8、Buffer(10×)1LL,10mmolöL光照培养。将阳性植株(T1代)移栽到盆中培养,收ATP1LL,灭菌水9.5LL,将此体系置于37℃合成集种子进行T2代筛选。同样的方法筛选T3和T4代反应40min。转基因苗,直到获得纯系的种子。退火:分别取0.5LL经磷酸化处理的片段,T41.2.5基因组
