mRNA差异显示法研究密叶杨×胡杨NaHCO3胁迫下基因的表达（国家“973”项目树木分子育种—耐盐基因克隆部分）

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1、摘要为了研究胡杨耐盐碱的分子机理，以正常生长和用4％NaHCO，(W／V)处理过的胡杨为研究对象，利用mRNA差异显示(DDRT-PCR)技术，通过ReverseNorthern杂交获得差异表达片段，并对基因片段测序和序列分析等研究。所得结果如下：(1)胡杨在受到4％NaHC03溶液处理后有特异基因表达。用NaHC03溶液浇灌胡杨苗3天后，取胡杨叶片进行mRNA差异显示，研究表明NaHCO。溶液处理后出现基因的差异表达。．(2)CTAB法提取胡杨组织的RNA质量高、完整性好，完全适用于DDRT-PCR，是一种快速、可靠的树木RNA提取方法。(3)建立了胡杨的mRN

2、A差异显示的体系。利用三种锚定引物和16种10碱基随机引物组合，展示了胡杨正常条件下和盐碱条件下基因表达差异方式。用银染法代替了放射性标记检测，操作起来更安全易行。该方法与ReverseNorthern斑点杂交结合使用，并进行多次重复操作，可很好地克服其假阳性高的缺点。(4)共获了24个差异条带的克隆。经ReverseNorthern杂交获得了4个阳性克隆。对其进行测序，序列相似性分析表明T12C—P1片段与atpH基因(该基因编码ATPase的一个亚基)有很高同源性，为重要的抗盐碱基因；TIzG—P6片段与已知蛋白序列同源性较低：T。2c—AP4序列与WD一40

3、重复蛋白基因同源性较高；TnA-AP4片段与钠离子通道蛋白基因有一定同源性，为抗盐碱相关基因。关键词：胡杨，mRNA差异显示技术，耐盐碱基因，ReverseNorthern杂交ABSTRACTInordertoanalyzethemolecularmechanismofsaltandalkalitoleranceinPopuluseuphraticaOliv,differentiallydisplayedeDNAfragmentswereseparated，andsequencedaftertheReverseNorthernDotBlotting，aswella

4、sanalyzedthroughthemethodofDDRT—PCRwiththeresultsasfollows：(1)ByDDRT—PCR，theresultshowedthatsomespecialgeneswereinduciblyexpressedundersaltandalkalistresswith4％NaHC03solutionforthreedaysinleavesofPopuluseuphraticaOliv．(2)CTABmethodisquiteidealtoextractthetotalRNAfromthisspeciesinDD-RT

5、andtheRNAisolatedhasgoodqualityandintegrity．Itwasalsoaquickandeffectivemethodforothertrees．(3)mRNAdifferentialdisplaysystemofPopuluseuphraticaOlivWasestablished．Combining3anchoredprimersand16arbitrarydeeamers，differentialdisplaypaRemofthetotalRNAfromtheleavesofPopuluseuphraticaOlivtre

6、atedbyNaHC03andthecontrolWasshown．Theprocesswasmadeeasierandsaferwhenthemethodofsilver-stainingwasappliedinsteadofradiolabeltest．Combined、Ⅳitllreversenortherndotblotting．DDRT-PCR’SseriousshortcomingwimhighrateoffalsepositivesCallbeovereomedthroughatleasttworepeatedtestsindependently．(

7、4)24differentiallydisplayedfragmentswerecloned，andfourofthemwereconfirmedaspositiveclonesbyreversenortherndotblottingandthenWassequenced．Bybothanalysisofnucleotideanddeducedanainoacidsequencesimilarity,T12C—P1andT12A-AP4hadsignificantidentitytOatpHgeneencodingATPasesubunitIIIandsodium

8、chann