银染mrna差异显示法克隆肝癌相关基因

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1、银染mRNA差异显示法克隆肝癌相关基因　　摘要:目的建立银染mRNA差异显示方法，筛选并克隆肝癌相关基因.方法以建系的人肝癌细胞HepG2和正常的肝细胞L02的总RNA为模板，用5’-dT11G锚定引物和8条随机引物（AP1～AP8）组合进行RT-PCR扩增，PCR产物经60g・L-1尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，凝胶银盐染色显示差异的DNA片段.结果建立了快速敏感的银染mRNA差异显示方法，分离并克隆了一些肝癌相关基因.结论建立的银染mRNA差异显示法简单、有效，在差异表达基因的筛选中有较高的实用价值.　　K

2、eyor;mRNAdifferentialdisplay;silverstain-ing;cloningofgene　　Abstract:AIMTodevelopmRNAdifferentialdisplaypoly-merizechainreaction（DD-PCR）methodtheHepG2cellsandL02cells.TheirfirststrainsofcDNAplifiedbyPCRusingananchoredprimer5’dT11Gbinedersrespectively.TheproductsofPCR

3、idegel.ThedifferentialDNAbandsongelRNAdifferen-tialdisplaydeveloped.CONCLUSIONTheestablishedmR-NAdifferentialdisplaymethod-ple，efficientmeansRNA差异显示（mRNAdifferentialdisplayPCR，DD-PCR）方法是分离差异表达基因的有效方法［1，2］.自从DD-PCR发明以来，已被广泛用于多种差异基因的筛选和克隆，即使DD-PCR方法有一定的局限性［3，4］，但近年来仍有许

4、多成功的范例［5-9］.虽然新的差异筛选方法如代表性cDNA差异显示，消减杂交和抑制性消减杂交等应运而生并异军突起，但因DD-PCR相对简单、直观、有效而仍受众多研究者的青睐［10-13］.常规mRNA差异显示法是通过放射性同位素进行放射自显影来比较表达基因的差异，因而给本方法的普及和操作带来了一定的困难，荧光染料法虽避免了同位素放射自显影带来的不便，但其价格较贵，且灵敏度与银染法相近.因而建立一套快速、简便、价廉、易掌握和推广的银染mRNA差异显示实用技术，在众多差异基因的初步筛选中具有很高的应用价值.我们结合自己的工作，以此

5、方法从肝癌细胞中初步分离并鉴定了一些肝癌相关基因.　　1材料和方法　　1.1材料　　人肝癌细胞系HepG2和正常肝细胞系L02购自中科院上海细胞生物研究所.菌株DH5α由本室保存.pUC-Tm载体购自上海生物工程公司.总RNA提取试剂盒，胶回收试剂盒，质粒提取试剂盒为上海生工产品.反转录酶M-MulV，Taq-PlusⅠ聚合酶为MBI产品，锚定引物和随机引物由生工合成.放射性同位素购自北京亚辉公司（α-32P-dATP和α-32P-dCTP）.　　1.2方法　　处于对数生长期的HepG2和L02细胞经酶消化后回收，清洗后，用总R

6、NA提取试剂盒提取两种细胞的总RNA，紫外检测仪测两种样品RNA的A260/A280，测RNA的含量和纯度，并用甲醛变性凝胶电泳检测样品中RNA分子的完整性;进一步用无RNA酶的DNA酶消化去除样品中可能含有的微量基因组DNA.各取5μgRNA样品，以H-T11G为锚定引物反转录合成cDNA第1链，然后以cDNA第1链为模板，T11G和8条随机引物（AP1～AP8）分别组合进行PCR扩增，PCR反应组成:在20μL体系中，RT产物各2μL，10×PCRbuffer2μL，MgCl2（25mmol・L-1）1.6μL

7、，dNTP（400mol・L-1）1μL，T11G（4μmol・L-1）1μL，Taq-DNA聚合酶0.15μL，去离子水11.25μL.PCR条件:95℃3min，94℃30s，40℃2min，72℃40s，40个循环，然后70℃10min终止反应.60g・L-1尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳:配制17cm×17cm×0.15cm60g・L-1尿素变性胶，各取8μLPCR产物，加入上样buffer，95℃变性3min，迅速冰浴，然后依次上样，TBE为电泳缓冲液，200～300

8、V恒压电泳6～8h，至二甲苯氰指示剂抵达胶底时结束电泳.　　凝胶银盐染色展示差异DNA条带参照文献［14-16］，略加修改.具体操作步骤:取下凝胶放入干净的玻璃器皿（托盘）中，去离子漂洗2～3min;100mL・L-1醋酸中摇动固定30min;去离