应用 mRNA 差异显示技术克隆常见舌苔相关基因.doc

《应用 mRNA 差异显示技术克隆常见舌苔相关基因.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、应用mRNA差异显示技术克隆常见舌苔相关基因作者：秦鉴吴正治吴国珍刘红健【摘要】目的：筛选、克隆常见舌苔厚度变化的相关基因。方法：利用荧光差异显示技术（FDD），选择厚腻苔、正常薄白苔、病理薄白苔、光剥苔各10例，提取其舌苔组织与正常人薄白苔组织中mRNA，通过电泳找到mRNA表达的差异。获得的差异表达cDNA片段经Notthern印迹证实后进行克隆和测序，分析其来源。结果：发现45条差异表达cDNA片断（38条证实为阳性），其中5条与人类98%以上同源，皆与细胞凋亡有关。结论：舌苔厚度变化与促进和抑制舌苔上皮细胞的凋亡基因有密切关系

2、。【关键词】舌苔；差异显示；基因在中医的四诊中，舌诊以其客观、明了、直接，被历代医家所重视。事实上，在中医临床辨证、立法、遣方、用药以及判断疾病转归、估计病情预后等方面，舌诊发挥着重要的作用[1]。目前，对舌苔形成原理的研究已逐渐深入到亚细胞水平和分子层次[2-4]。传统中医理论认为，舌苔的形成是胃气上蒸于舌面的结果，这种阐释过于抽象、感性和简单。随着科技水平的迅猛发展，研究中医舌诊中的分子生物学事件已经是人们深入研究中医疾病发生发展机理的必然途径。本研究拟采用先进、简便、成熟的差异显示逆转录聚合酶链反应（DDRT-PCR）法，从相关

3、基因层次探讨常见舌苔发生、发展、变化的机制，探寻其分子生物学基础，丰富舌苔诊断的内容，全面认识舌苔产生的本质、完善中医舌苔理论、指导临床的诊断治疗、促进中医诊断的客观化、定量化、规范化。1对象与方法1.1标本来源病理舌苔受检者均系中山大学附属第一医院门诊及住院病人，病种不限，但注意各组病种分布的平衡；正常组选择无全身各系统器质性病变，并排除近月内舌、口、鼻、咽等局部病变，舌质淡红、舌苔白而润者。参考《中医诊断学》舌诊标准辨舌苔[5]，分为4组：正常薄白苔组10例，其中男6例，女4例，年龄33~52岁；病理薄苔组10例，男4例，女6例，

4、年龄38~55岁；厚苔组10例，男7例，女3例，年龄46~63岁；剥苔组10例，男5例，女5例，年龄45~67岁。经统计学分析，各组性别、年龄分布无显著性差异。80例进行临床验证：正常薄白苔组20例，男10例，女10例，年龄38~55岁；病理薄苔组20例，男11例，女19例，年龄43~56岁；厚苔组20例，男7例，女13例，年龄36~58岁；剥苔组20例，男9例，女11例，年龄46~61岁。两次研究对象组间性别、年龄分别比较，无显著差异（P>0.05）。5每个观察对象用经高温高压消毒的丝瓜络用力刮取舌背中部（花剥苔者取无舌苔覆盖

5、部位）舌苔，装于有预冷生理盐水（含0.1%DEPC）的10mL具塞离心管中，洗涤、涂片后-70℃密闭保存备用。1.2总RNA的抽提取冷藏标本1mLTrizol试剂（美国GIBCOBRL公司）中快速电动匀浆，按厂家提供说明抽提组织总RNA。琼脂糖凝胶电泳检验RNA质量，紫外分光光度仪测定浓度及纯度，总RNA的A260/A280比值在19~20之间。1.3荧光差异显示荧光差异显示试剂盒（mRNAprofileKit、fluoroDDKit购自美国Beckman公司）。1.3.1逆转录反应将取四组样品的总RNA，稀释至0.5g/L，取2LR

6、NA，加2L2mol/L的3′锚式引物，70℃温育5min，在冰上快速冷却。加入2Ll250mol/LdNTP，2L100mmol/LDTT，4L5×逆转录缓冲液，7.8L无RNA酶水，0.2L200U/L逆转录酶（美国GIBCOBRL公司），42℃温育5min，50℃温育50min。72℃温育15min灭活逆转录酶，-20℃保存备用。1.3.2PCR反应0.95L水，1L10×PCR缓冲液，1.5L25mmol/LMgCl2，2L250mol/LdNTP，1.75L2mol/L5′随机引物，0.7L5mol/L荧光素标记的3′锚式引

7、物，2L逆转录产物，0.1L5U/LTaq酶（GIBCOBRL），在PCR仪上进行如下反应：95℃2min；94℃30s，50℃40s，72℃2min，共4个循环；94℃30s，60℃40s，72℃2min，共30个循环；72℃延伸7min；保存在4℃。PCR产物上样于5.6%的聚丙烯酰胺凝胶，在GenomyxLR电泳仪上进行垂直高压电泳5h。电泳结束后50℃干胶15min，然后在在GenomyxSC荧光图像扫描仪下扫描图像，比较、确定有差异的cDNA条带。1.4差异条带的回收及再扩增利用方格图定位，切取含有差异cDNA条带的干胶条，

8、浸于50LTE溶液中捣碎，37℃孵育1h。取其中的4L用通用引物M13和T7进行再扩增。二次PCR反应体系为189L水，4L10×PCR缓冲液，15L25mmol/LMgCl2，32L250mol/LdNTP，各4L2m