荧光标记mrna差异显示技术

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1、荧光标记mRNA差异显示技术mRNA差异显示技术（differentialdisplay，DD）是用于研究基因的差异表达的新方法。该技术自1992年被首次报道后，即以其不可替代的优势被广泛应用于生物医学领域。在应用过程中不断得到改进，并产生了诸多衍生技术如RPA（RNAfingerprintingbyarbitrarilyprimedPCR）、GDD（genomicDD）等。本文简要介绍在本试验室荧光标记差异显示技术（fluorescentDD，FDD）的应用及体会。1.材料与方法1.1标本人单核细胞系U937，细胞

2、密度2×108/L，分对照组（N）、处理Ⅰ组（T1）、处理Ⅱ组（T2），N用1640培养基及10%胎牛血清培养，T1用IFN-γ104U/LLPS1μg/L、T2用IFN-γ10U/LLPSl0μg/L分别刺激7h.1.2主要试剂与仪器TRIzol试剂（GIBCOBRL）、FluoroDD试剂盒（Genomyx）、SupersriptⅡ逆转录酶（GIBCO BRL）、AmpliTaqDNA聚合酶（GIBCOBRL）、RNase-freeDNaseI（Promega）；GenomyxLR、GenomyxSC、DNATh

3、ermalCycler（PerkinElmer）1.3总RNA的制备按试剂盒提供的方法分别提取三种细胞的总RNA,以RNase-freeDNaseI（终浓度80000U/L）除去其中污染的DNA,经甲醛变性凝胶电冰鉴定其完整性，并以紫外分光光度计检测其纯度1.4mRNA差异显示1.4.1逆转录反应选择锚定引物[T7（dT12）AP(anchoredprimers，AP)]，序列为5'ACGACTCACTATAGGGCTTTTTTTTTTTTMN3'，其中M=A/G/C。N=A/G/C/T],以总RNA为模板进行逆转录

4、反应，每管反应体系如下：总RNAl.0μg，AP4pmol，70℃5min，加入50mmol/LTris-HCl（pH8.3），75mmol/LKCl，3mmol/LMgCl2，10mmol/LDTT，25μmol/L，dNTPmix（1∶1∶1∶1），SuperScriptⅡ60Units，总反应体系20μl，42℃5min，50℃50min，70℃15min。1.4.2荧光标记差异显示PCR 选取与逆转录引物序列相同的带荧光物质标记的锚定引物[TMR-T7(dT12)AP]，随机引物（5'ACAATTTCACAC

5、AGGAACGCTAGTTG3'），以逆转录产物为模板，进行PCR反应。反应体系包括：20mmol/LTris-HCl（pH8.4），50mmol/LKCl,3.75mmol/LMgCl2，逆转录产物3.0μl，50μmol/LdNTPmix（1∶1∶1），0.35μmol/L5'-随机引物，0.35μmol/L3-锚定引物，AmpliTaq0.5Units，总反应体系10μl。反应步骤如下：95℃2min；94℃15s，50℃30s，72℃2min，4个循环；94℃15s，60℃30s，72℃2min，个循环；72

6、℃延伸7min。1.4.3分离差异显示片段配制5.6%变性聚丙烯酰胺凝胶，胶厚0.25mm，大小61×33cm。将PCR产物加4.0μl上样缓冲液，95℃变性后上样。3000V、100W、55℃电泳4.5h。干胶后置于GenomyxSC扫描，用系统所带的AcquireSCprogram软件分析处理扫描结果。1.4.4回收差异条带用AcquireSC软件将差异条带定位，用一次性手术刀片切割下所需条带，置于30μl去离子水中，37℃水浴30-60min，备用。1.4.5差异条带的再扩增以经上述处理的回收条带为模板，T7启

7、动子22-mer（5'GTAATACGACTCACTATAGGGC3’）、反M13（-48）24-mer（5'AGCGGATAACAATTTCACACAGGA3'）为引物，进行再扩增反应：模板2.0μl，20mmol/LTris-HCl（pH8.4），50mmol/LKCl，1.5mmol/LMgCl2,20μmol/LdNTPmix（1∶1∶1∶1），0.2μmol/LT7、0.2μmol/LM13-r、AmpliTaq1.0Units，总反应体系20μl.反应条件同差异显示PCR。2.结果2.1总RNA的质量总R

8、NA经DnaseI处理，用1.0%甲醛变性凝胶电泳，可见清楚的28S、18S、5S条带，且28S/18S约为2∶1（图1），表明RNA完整性好，无降解现象。N、T1、T2的OD260/OD280比值分别为1.92、1.83、1.98，表明样品纯度高。Fig.1ResultoftotalRNAonformaldehyde-agarosegel2.