mrna差异显示技术及其研究进展

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1、http://www.paper.edu.cnmRNA差异显示技术及其研究进展郑珂大连水产学院生命科学与技术学院(116023)kzheng@163.com摘要：控制生物形状的基本单位是基因，研究细胞的基因表达一直是分子生物学的重要课题之一。不同细胞间基因表达的差异决定了生命活动的多样性，如发育与分化、内环境稳定、细胞周期调节等。近年来，随着DNA重组技术的发展，已有数万个人类基因被克隆分析(人类约30000～35000个基因)，要从如此众多的表达基因中找出引起细胞生理或病理变化的基因并非易事。mRNA差异显示技术（DDRT－PCR）的出现将有可能在一定程度上起到关键作用。本文主要从该技术的原

2、理、优缺点及其改进、应用现状和前景等方面作了阐述。关键词：mRNA差异显示技术cDNA锚定引物随机引物1.引言[1]1992年，美国波斯顿Dena－Farber癌症研究所的两位科学家Liang和Pardee创立了mRNA差异显示技术，这是一种研究基因的差异表达的新方法。该技术最初是以研究与癌症发生有关基因为目的，创立的一种鉴定与克隆哺乳动物正常生理状态与异常生理状态之间差异表达的基因的方法，首次报道后，即以其不可替代的优势被广泛应用于生物医学领域，在应用的过程中不断得到改进，已比较成功地应用于动物及人类癌症、心脏病、糖尿病、胚胎[2]发育、脑发育、生长因子激活与抑制有关的基因的鉴定与克隆。就目

3、前而言，该技术在植物中的应用虽然落后于人类和动物，但在植物发育、抗病抗逆生理、遗传与育种等相关基因的比较鉴定、分离与克隆方面取得不少突破。据估计，高等生物中大约有100000个基因，但在每一个细胞中只有一小部分约15%在[1]表达，正是这种基因表达水平及模式的变化控制着生物体的整个生命过程及其代谢变化。因此，研究比较差异表达的基因对揭示生命活动的规律有着重要意义。mRNA差异显示技术从1992年创立以来经过众多学者的不断改进，得到完善与发展，并显示了广阔的应用前景。本文对其原理、优缺点及其改进、应用现状及前景等方面作了综述。2.mRNA差异显示技术的基本原理与方法2.1mRNA差异显示技术的基

4、本原理mRNA差异显示技术是将mRNA逆转录技术和PCR技术相结合的一种RNA指纹图谱技术。每一种细胞（包括同一组织细胞经过不同的处理）都有其特异表达的不同于其他组织细胞的基因谱（有差异基因表达），即特异的RNA指纹图谱。差异基因表达是细胞分化的基础，正是这些基因在细胞中的特异表达与否，决定了生命历程中细胞的发育和分化、细胞周期调节、细胞衰老和凋亡等。mRNADDRT－PCR技术正是对组织特异性表达基因进行分离的一种快速而行之有效的方法。其基本原理是从基因背景相同的2个或几个被比较的细胞系或组织中提取总RNA，逆-1-http://www.paper.edu.cn转录成cDNA，用不同引物对，

5、进行PCR扩增，扩增时加入同位素标记的核苷酸。利用测序胶电泳技术分离PCR产物，经放射自显影即可找到差异表达的基因。2.2mRNA差异显示技术的方法该技术利用真核生物细胞mRNA3’末端均含poly（A）的特点(除极少部分mRNA,如组[3]蛋白mRNA外)，设计了引物oligo（dT）12MN(或oligo（dT）11MN)，其中M称为锚定引物，是A、C、G三种碱基中的任何一种，起增大引物Tm值的作用，N称为分类碱基，是A、C、G、或T中的任何一种，对逆转录进行归类。MN共12种组合，即3’端引物共12种，用这12种引物分别对同一总RNA进行cDNA合成，即进行12次不同的逆转录反应，从而使

6、逆转录的cDNA具有12种类型，也就是对cDNA进行12种归类（目前较为流行的是进行3种归类，即3’端引物采用oligo（dT）12M，M为A、C、G中的任何一种），每一种引物只能起始某一部分mRNA的逆转录。在随后的PCR中，利用此锚定引物与5’端10个碱基的随机引物组合进行扩增。5’端引物能随机与cDNA的任一位置结合，从而得到大小不同的扩增产物。理论上，通过12种3’端锚定引物与20种5’端随即引物的组合，即可检测出所有的mRNA。扩增时dNTP中一种（常用dATP）以放射性同位素标记，使PCR产物在测序胶上电泳，通过放射自显影，即能观察到mRNA在不同类型的细胞间的差异表达。mRNA差

7、异显示技术的后续工作也很重要，需要回收差异条带，用相同的引物对进行二次扩增后，产物用作探针进行NorthernBlot杂交，检验和证实所得的差异条带cDNA确实存在。鉴定确实存在后重组到载体，转化到宿主细菌里或包装成噬菌体颗粒进行克隆，然后再对克隆的片断测序和在GenBank数据库进行BLAST查询，以了解该序列有关的信息。如该序列是否为新基因，数据库中是否存在其相应的或同源的EST（Expres