mrna差异显示方法研究进展-第1

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1、mRNA差异显示方法研究进展

2、第1　[关键词]DD-PCR　骨科学研究马庆军　100083北京医科大学第三医院骨科党耕町　100083北京医科大学第三医院骨科宋国立　美国加州大学圣地亚哥分校骨科与生物工程系哺乳动物细胞约有100?000个不同的基因，在一定时间、空间中仅有10％～15％的基因表达，这种表达受到严格调控［1］。运用mRNA差异显示（differentialdisplay,DD）方法［2］，可将不同细胞类型或同一细胞在不同环境下表达的基因进行比较，从分子生物学水平上提供信息，这对理解细胞的生命过程极有帮助。该技术一经问世，立即得到广泛应用，但同时也遇到许多问题，所

3、以Debouck［3］曾对该方法提出质疑。现将DD的研究进展简要综述如下。一、DD方法基本原理DD的基本原理是将具有可比性的细胞在某一条件下可表达的mRNA群体通过逆转录方法变成相应的cDNA群体，以此为模板，利用一对特殊引物，即3anchor引物和5arbitrary引物，在一定条件下进行PCR扩增，得到与mRNA相对应的“标签”（tags），然后用变性聚丙烯酰胺测序胶分析其差别，将有差别的基因克隆化，进一步分析其结构与功能。DD依赖三种技术：（1）mRNA逆转录技术；（2）以特定引物进行的PCR技术；（3）DNA测序胶电泳技术。二、DD方法的优点及其应用用某一方法来寻

4、找mRNA表达的差异，至少要满足下列要求：（1）在一定时间、空间里，每一个细胞约有15000种mRNA表达，其中除少数属高丰度表达外，大量的属于低丰度表达，即要求使用的方法足以显示低丰度mRNA；（2）重复性要好；（3）实验过程中能够步步验证比较（side-by-sideparison）；（4）得到的产物能代表相应的mRNAs或cDNAs，并能由此找到相应的cDNA序列；（5）省时，简便易行。既往对mRNA的比较研究中多用减数杂交方法［4］（subtractionhybridization），该方法灵敏，可显示低丰度RNA，但是步骤复杂，需时较长，而且在得到最终结果前无法步步

5、验证对照比较，故不易重复，并且需要大量的RNA作起始研究材料。这一点对RNA不易者（如手术活检标本）极不利［5，6］。DD的优点在于：（1）仅需0.2μg总RNA作为起始材料；（2）可同时分析多组样品；（3）敏感性高，可检出低丰度mRNA；（4）实验周期短，约8天即可完成［7］，便于重复；（5）最突出的优点是实验过程中可步步验证比较。可简单地将DD的特点概括为“3SRV”，即“Simplicity，Sensitivity，Speed，Reproducibility，Versatility”。DD方法因有上述优点，被广泛应用。例如：Musholt等［8］应用DD方法对手术切下的

6、髓样甲状腺癌标本与局部转移的淋巴结进行了比较，发现了两个新的表达基因MDF-1和MDF-2，并认为这两个基因在髓样甲状腺癌的进展与转移中起了重要作用；Zuo等［9］研究溃疡性结肠炎的粘膜细胞，以正常结肠粘膜细胞作对照，找到了25个表达基因，其中有些与甲状旁腺瘤、T细胞受体-β、卵巢癌等表达的基因同源。关于神经再生问题，Livesey等［10］发现了Reg-2基因，并认为该基因是哺乳类动物运动神经元再生的关键基因。在骨科领域，也有许多用DD方法的研究，Ryoo等［11］找到了一个与成骨细胞表型发育有关的细胞增殖标志基因PROM-1（proliferatingcellmarker

7、）。更令人鼓舞的是，Boden等［12］用一种新的骨形成蛋白LMP-1基因转染骨髓细胞，再作局部基因治疗，在动物实验中成功地进行了脊柱融合，LMP-1基因就是用DD方法克隆出来的。此外，DD还应用于心血管病［13］、糖尿病［14］、胚胎发育［15］、先天性疾病［16］以及药理学［17］和眼科学［18］等。不仅用于动物和人类，还应用于植物分子生物学研究［19］。三、存在的问题与对策DD方法存在的问题概括起来有两方面：一是假阳性多（约50％～70％），二是得到的有差异cDNA片段短（约为110～500bp）。因为这两个问题，使许多研究者踟蹰不前，这也是Debouk［3］提出质疑的

8、原因之一。产生假阳性的原因，在于以下4个环节：（1）提取总RNA时，有染色体DNA污染，此DNA作为模板在PCR过程中被扩增；（2）从聚丙烯酰胺胶上挑选有差异条带时，实验组与对照组间信号对比不够显著；（3）在克隆阶段挑选阳性菌落时，未能排除基因克隆中的假阳性；（4）研究中多次使用PCR技术，很难避免实验室环境中的交叉污染。解决这一问题的对策是：（1）提取RNA操作严格，得到的RNA必须经过脱氧核糖核酸酶I(DNaseI)充分消化，去除染色体DNA污染。（2）从聚丙烯酰胺胶上切取有差异条带时，首选实验与对