mRNA差异显示方法的建立及条件优化

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1、万方数据文章编号：1007—6611(2008)04—0289—04mRNA差异显示方法的建立及条件优化·289·王小伟，孙俊红，籍晓元，杜秋香，王英元(山西医科大学法医学院病理学教研室，太原030001)摘要：目的研究大鼠皮肤肌肉特异性基因的表达，探讨引物的不同、退火温度变化与扩增产物特异性之间的关系。方法12只健康雄性Sprague-Dawley大鼠分为正常对照组与实验组(挫伤4h)。分别提取总RNA，反转录成eDNA，通过不同引物、退火温度及反应体系进行PCR产物扩增，比较不同条件下差异条带的情况。结果总RNA量在

2、2—4耀时，扩增条带最亮；提高反转录温度有利于长片段eDNA的合成；使用T8KaRa公司带有17启动子的OligodTl2NM和M13的随机引物时，可最大限度地减少非特异性条带；先使用低严谨的退火温度，再使用高严谨的退火温度可显著地增强差异条带重复性和敏感性。结论差异显示技术方法简便、灵敏、高效，适用于一般性的基因差异表达研究。关键词：差异显示技术；锚定引物；随机引物；退火温度中图分类号：Q789文献标识码：AEstablishmentandoptimizationofmRNAdifferential-PCRWANGXi

3、ao-wei，SUNJun-hong，jIXiao-yuan，DUQiu-xiang，WANGYing-yuan(DeptofPathology，SchoolofForensicMedicine，Shan．riMedicalUniversity，Taiyuan030001，China)Abslract：ObjectizeTostudyskin-andmuscle-specificgeneexpression，andtoexploretherelationshipbeDareendifferentprimers，annea

4、lingtemperaturesandspecificamplificationinrats．MethodsTwelvehealthymaleSprague-Dawleyratswererand

5、nealingtemperaturesindifferentreactionsystem．ResultsAmplifi．cationWSSthehighestwhentotalRNAwas2—4越．TheincreaseofreversetranscriptiontdIaperaturewasusefulforlargeeDNAfragmentsynthesis．OligonueleotidedTl2NMwithT7p11DlT斌盯andrandomprimerswithM13maximizedthereductiono

6、fnon-sps．cificbands．Annealingternperaturessignificantlyenhancedsensitivityandreproducibilityofdifferences．ConclusionDifferentialdisplayissimple，sensitive，efficienttOgenedifferentialexpression．Keywords：differentialdisplaytechnique；anchoringprimer；arbitraryprimer；a

7、nnealingt口nperature基因的差异性表达不仅是细胞形态和功能多样性的根本原因，而且也是各种生理、病理及损伤过程的物质基础。因此，分离、鉴定差异表达的基因具有重要的意义。真核生物基因组中，仅约有10％一15％的基因在细胞中表达，而且不同发育阶段、不同生理状态和不同类型的细胞中表达的基因也不尽相同。mRNA差异显示技术是在转录水平上研究基因表达差异的有效方法，其通过一系列的锚定引物与随机引物组合把不同种细胞的mRNA进行分组逆转录及PCR扩增，在相邻泳道上显示扩增结果，通过比较电泳图谱找出差异，对各种不同类型、

8、不同分化时期以及异常细胞差异表达基因进行分离和比较，具有简单、快速、灵敏、重复性好的特点。研究引物的改进、退火温度变化与扩增产物特异性之间的关系，将有助于发现新的特异性基因的表达。1材料和方法1．1试剂、仪器与动物PrimeScriptTMReverseTranscriptase，砌(aRaTaqTM，Ribonuc