mrna差异显示技术在肿瘤研究中的应用(1)

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1、mRNA差异显示技术在肿瘤研究中的应用(1)　　mRNA差异显示技术（mRNAdifferentialdisplay）是一种快速而有效的克隆差异性表达基因的方法。1992年Liang和Pardee［1］首次应用差异显示技术对比人类乳腺癌细胞与正常乳腺上皮细胞所表达的mRNA，以此来克隆癌细胞所特有的基因。差异显示技术为寻找新基因开辟了捷径，是该领域的重大突破,已应用于各个领域，如农业、植物、动物、医学；就医学而言，涉及了胚胎发育器官形成、遗传性疾病、药物作用原理、基因治疗和免疫反应等研究领域，特别是在人类与肿瘤的战斗中有着

2、极为广泛的用途。　　　　差异显示的理论基础是基因的选择性表达。哺乳动物基因组约含100000个不同的基因，对于某一细胞而言，仅一小部分（约15%）表达。在正常细胞的生长分化过程中，基因的选择性表达决定着生命的进程；在病理过程中，作为疾病的原因或结果，也存在着表达的基因异常。因此克隆这些差异表达的基因是当前生物医学领域的研究热点，该领域的不断深入将为从分子水平了解疾病的发生和发展规律奠定基础，并为临床合理的治疗提供依据。　　　　差异显示的关键在于选择具有高度可比性，表型特性差异显著的对比对象。可比性即严格控制遗传背景，摒除无

3、关差异，仅使所关注的表型（如肿瘤细胞的转移潜能）具有显著差异。差异显示从表型差异入手，通过展示mRNA的差异深入到基因差异，克隆与表型差异高度相关的新基因。　　　　就技术而言，差异显示巧妙地结合了两个基本的分子生物技术：逆转录-聚合酶链反应及电泳。经过不断的改良，差异显示已成为标准化的cDNA克隆方法，有多个公司的试剂盒及设备使研究者可在短时间内启动差异显示，几天内获得结果。较其他克隆新基因的方法而言，差异显示具有简便易行的优势，因此在基础和临床研究中有着推广和普及的可能性。　　　　一、技术路线　　　　差异显示技术实质是R

4、T-PCR,其独特之处在于2种PCR引物的设计:锚定引物T12MN,含12个T可以结合于mRNA3’端poly，M为AGC3种碱基之一，N为AGCT之一，如T12CA可结合于在poly上游为GT的mRNA；随机引物可以在与poly末端不同距离的多个位置上结合，因此差异显示的产物是不同长度的cDNA片段混合物。通过随机引物和锚定引物的多种组合,差异显示有展示约10000至15000种mRNA的潜力，在DNA测序胶上对比细胞或组织中所表达的mRNA，从而寻找在不同细胞，不同发育和分化阶段，不同部位差异表达的基因。目前引物的设计

5、更为新颖有效，如GenHunter公司在引物末端加入HindIII酶切位点，便于克隆；Genomyx公司则在锚定引物5′末端加入T7RNA多聚酶启动子,在随机引物3′末端加入M13引物序列,便于直接合成反义RNA探针及直接的双相测序。随引物的延长,退火温度可由40℃提高到46℃,提高了差异显示的重复性。另外可针对某一基因家族设计引物,使所获得的差异基因相对集中。　　　　其技术路线为：首先提取高质量的总RNA,DNA酶处理后利用锚定引物T12MN逆转录,其后应用相同的T12MN及随机引物进行PCR扩增；同时掺入同位素来标记产

6、物。产物用测序胶电泳分离，放射自显影。将差异条带切下，用相同的引物进行2次PCR扩增。产物经标记制成探针，通过Northern杂交来验证其在不同样本中的表达差异，去除假阳性。被证实的cDNA片段可克隆到T/A载体中进行测序，其序列与Genbank数据库进行同源性检验，便可确定是已知基因或者是与已知基因无显著同源性的未知基因。目前已有多种非放射性标记方法,如溴化乙锭染色的琼脂糖电泳［4］、银染［5］、荧光［6］及化学发光［7］。　　　　二、差异显示的优越性　　　　1.差异显示仅需少量的总RNA（～μg,约相当于从200个细胞

7、中所提取的总RNA）。这使得材料来源困难的研究成为可能，如细针穿刺细胞学标本，内窥镜活检标本等。用总RNA和polyRNA做模板可获得相同结果，这也说明在大量的tRNA，rRNA存在的情况下，锚定引物T12MN能特异的结合于mRNApoly的尾部。　　　　2.差异显示应用PCR技术，起到了放大作用，敏感度高。为了筛选低转录水平的mRNA已进行了许多改良，如Hakvoort等［8］将消减杂交与差异显示结合，先通过杂交使差异片段富集，再进行并列比较，则低转录水平的mRNA得到展示的可能性大大提高。又如Ralph等［9］通过2轮

8、PCR扩增（巢式），第2轮引物较第1轮在3′端多2个碱基，使与之匹配的模板减少，模板间的竞争减少,因此低转录水平的mRNA易于被扩增。　　　　3.差异显示在测序胶上同时并列比较2个或多个研究对象，比如转移潜能高、中、低的癌细胞系，使后期在选择差异片段时有所参考。同时回收那些出现或消失的差异条带，则可获得