盐胁迫下西伯利亚蓼cdna文库构建及表达序列标签（est）分析（国家“973”项目树木育种的分子基础研究——耐盐基因克隆部分）

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1、摘要为了研究西伯利亚蓼耐盐的分子机理，使用Stratagene的cDNA合成和GigapackIIIGold包装试剂盒构建了盐(NaHC03)胁迫下西伯利亚蓼的cDNA文库，随机选取重组克隆测序，用表达序列标签(EST)方法研究盐胁迫下西伯利亚蓼基因的表达。蓝白斑检验结果表明cDNA文库滴度为1．2×106，重组效率为95．9％，PCR检测及序列分析结果验证插入片段平均长度大于450bp。随机选取2688个重组克隆测序，从2575个克隆获得了有效序列。通过本地BLAST和序列多重对齐分析，从这些序列得到1651个独立的序列。网上BLAST比对显示其中1118个序列与

2、己知基因相似，其余533个为未知功能的开放阅读框(其中101个已在其它生物中发现，423个为新发现的序列)。在构建的文库中植物胁迫响应基因转录丰度较高，尤其是渗透胁迫基因。例如：H+．转运ATP酶蛋白、甜菜碱醛脱氢酶(BADH)、过氧化氢酶(catalase)、山梨醇脱氢酶(sorbitoIdehydrogenase)、钙调蛋白(CaM)、脯氨酰异构酶(prolylisomerase)、热休克蛋!刍(heatshockprotein)、通透酶(permease)等。我们还对部分序列做开放阅读框分析，利用推定的氨基酸序列进行疏水性分析，为研究蛋白的功能和细胞内定位提供

3、线索。本项研究构建的文库、dbEST数据库和相关的材料、信息，为进～步研究西伯利亚蓼在盐胁迫下基因的表达调控及耐盐的分子机理奠定了基础。关键词：西伯利亚蓼盐胁迫基因表达序列标签生物信息学AbstractExpressedsequencetag(EST)analysiswascarriedouttostudythemolecularmechanismofsalttoleranceforPolygonumsibiricumLaxm．．AcDNAlibrarywasconstructedfromPolygonumsibiricumLaxm．treatedbysaltusi

4、ngStratagenecDNAsynthesis&Gigapack111GoldCloningKit．Thelibrarysizeis1．2x106recombinants．Theaveragelengthofinsertedfragmentsinthelibrarywaslongerthan450bp，whichWaStestifiedbybothPCRandsequencinganalysis．2688clonesselectedrandomlyweresequenced，wherepartialsequenceswereobtainedfrom2575clo

5、nes．Homologyanalysisbylocalblastandmultiplealignmentshowedthattheseclonesrepresented1651uniquetranscripts．Itsuggestedthat18contigswerehomologoustothegenesidentifiedpreviouslybyblastfromtheInternetwhileother533contigsmatchedunknownproteincodingregions(inwhich101hadbeenfoundbeforeinother

6、organismsand432werecompletelynovel)．Transcriptsofplantstressresponsegeneswereabundantinthelibrary,especiallythoseinvolvedinosmoticstress，forinstance，thegenesencodingH+-transportingATPsynthaseprotein，BADH(betainealdehydedehydrogenase)，permease，CaM(calmodulin)，catalase，sorbitoldehydrogen

7、ase，prolylisomerase，heat—shockproteinandSOon．Openreadingframes(ORF)werefoundinsomenovelsequencesfromthelibrary．afterthat，putativeaminoacidsequenceswereobtained，andhydrophobicityprofilewereanalysed．ThedbESTandtheassociatedDNAmaterialsinthisstudywillbeausefulresourcetostress．tolerancer