柱状黄杆菌基因转移系统的构建及应用

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1、中国科学院博士学位论文DoctoralDissertation，ChineseAcademyofSciences柱状黄杆菌基因转移系统的构建及应用Developmentandapplicationofthegenetransfersystemfor1r'--．●l，lavobactertumCol量fJ咒刀口，℃张金ZhangJin指导教师：聂品研究员DirectedbyProfessorNiePin中国科学院水生生物研究所InstituteofHydrobiology,ChineseAcademyofSciences二零零九年六月June，2009摘

2、要摘要柱状黄杆菌，是柱形病的病原，它是在全世界范围内危害淡水鱼类的最重要的病原菌之一。柱形病会使鱼烂鳃、体表溃疡、皮肤坏死和鳍条腐烂，导致很高的死亡率。在本研究中，我们在柱状黄杆菌中建立了一个依赖于整合胺合质粒的基因转移遗传系统，并利用该技术通过插入失活实现了嗜热菌蛋白酶基因的敲除。我们克隆和分析了一个可能的看家基因乙酰辅酶A合成酶基因(口甜)的全长及其侧翼序列。我们确定了ACS的转录起始位点(TSP)是位于tiCS起始密码子ATG上游46bp的“r’。在TSP的上游的．7和．33区我们发现了具有启动子特征的保守基序“TA册CG”和“TTG”。通过将a

3、c$启动子Pacs分别融合在两个抗生素抗性基因cat和口口幽的开放阅读框前面，为柱状黄杆菌构建了两个抗生素筛选标记ACAT和ASP。这两个人工筛选标记不仅能够赋予柱状黄杆菌氯霉素和壮观霉素抗性，还能在大肠杆菌中起到很好的筛选作用。我们分别构建了含有这筛选标记ACAT和ASP的整合，接合质粒pGL002和pGL006。在这两个质粒中，有四个重要的元件。它们是使质粒在大肠杆菌中增殖的pUCori、使质粒能够被接合转移的oriT．在柱状黄杆菌和大肠杆菌中起筛选作用的ACAT或ASP以及介导质粒与柱状黄杆菌染色体同源重组的7kb的特异染色体片段(SCF)。通过

4、电穿孑L和接合转移的方法将pGL002和pGL006导入柱状黄杆菌G4细胞后，我们分别获得了稳定的具有氯霉素和壮观霉素抗性的接合转移子或者转化子，并将它们分别命名为GL002和GL006。通过从形态和分子水平进行验证，我们确定了GL002和GL006都是质粒pGL002和pGL006插入柱状黄杆菌G4染色体的SCF区域后得来的。经验证，菌株GL002中CAT的TSP与G4中的ACS的TSP是在同一个位置。这说明，我们克隆的启动子Pacs确实能够调控cat在柱状黄杆菌中的表达并使被转入的细胞产生氯霉素抗性。通过删减分析启动子Pacs，我们发现起始密码子上

5、游164bp对于稳定的启动子活性和驱动作为筛选标记的cat的足量表达都是必需的。通过分析和比对32个基因的核糖体结合位点区域，我们发现了具有黄杆菌属特征的RBS保守基序“TAAAA”。这个基序也存在于ac$的起始密码子上游10bp位置。通过反复优化接合时间和温度等条件，我们成功地将接合转移效率提高到了4．0x10～．4．6×10_5接合转移子／受体细胞。但是，采用电穿孔对pGL002和pGL006进行基因转移时，效率十分低(每次转化只有0—5个抗性克隆)。我们认为这是因为接合转移的方法能够更好摘要的克服限制性屏障对基因转移的阻碍。我们也确实在六株柱状黄

6、杆菌中都发现了限制性屏障的存在。包含G4在内的六株柱状黄杆菌都能够分泌活性较强的DNA酶。在它们的细胞壁上我们也检测到了能够降解九DNA、质粒pRL277和宿主基因组DNA的DNA酶活性。我们通过这个基因转移技术成功实现了嗜热菌蛋白酶基因的插入失活。将基因内部的一个片段克隆至自杀载体pZJ002中构建了整合／结合质粒pMTH002。接合转移入柱状黄杆菌G4后，pMTH002就插入了嗜热菌蛋白酶基因的内部使其遭到破坏。同时，我们采用质粒拯救的办法建立了一个快速简单地获取被插入基因侧翼序列的方法。总之，我们第一次为柱状黄杆菌G4建立了一个有用且稳定的整合／

7、接合质粒依赖型的基因转移系统。这个技术的成功建立使得柱状黄杆菌的遗传操作成为可能，同时能帮助开发更多有用的适合柱状黄杆菌的遗传操作工具，最终为从分子水平研究柱状黄杆菌的致病机理和开发合理的疫苗菌株奠定基础。关键词：柱状黄杆菌、ac$、Pacs、整合／接合质粒、外源基因转移、同源重组、RBS、限制性屏障、基因敲除AbstractFlavobacteriumcolumnare，theaetiologicalagentofcolumnarisdisease，isoneofthemostimportantbacterialpathogensoffreshwat

8、erfishworldwide．Columnarisdisease，characterized