喜温硫杆菌遗传转移系统建立及抗砷基因工程菌构建

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1、山东大学硕士学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果．除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律责任由本人承担。论文作者签名：日期：丝：!：!!关于学位论文使用授权的声明本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以

2、将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。(保密论文在解密后应遵守此规定)论文作者签名：趁导师签名：山东大学硕士学位论文摘要喜温硫杆菌(Acidithiobacillu$caldus)是1994年分离出来的新菌种，是一类专性自养极端嗜酸性硫杆菌，广泛分布于硫化矿床，酸性矿水及土壤中，在细菌冶金，煤的脱硫和含硫废水的处理等方面发挥重要作用，同时在自然界的硫循环中也占有重要地位．但是在实际应用过程中，因为该菌生长缓慢、细胞得率低以及对重金属如砷

3、、汞、银等缺乏抗性等弱点，不仅限制了其应用范围，而且也给实验室的研究工作带来许多不便．要想充分发挥生物冶金的功能，对喜温硫杆菌进行遗传改造势在必行．首先，实验证明了具有广泛寄主的IncP类群质粒RP4和R68．45可以从大肠杆菌接合转移至喜温硫杆菌中，IncP类群质粒的抗生素抗性基因在喜温硫杆菌中可以表达．RP4和R68．45从喜温硫杆菌可以反向接合转移到大肠杆菌中．利用IncP类群RP4质粒诱动或整合到大肠杆菌SMl0染色体上RP4的帮助，广泛寄主IncO类群载体质粒pJP,D215能够稳定地接合转移到喜

4、温硫杆菌中，并在喜温硫杆菌中稳定地存在，同时基因标记(Kmr，Sin')可以在喜温硫杆菌中表达．由此建立了大肠杆菌和喜温硫杆菌之间的接合转移系统．其次，以pJRD215为载体构建带有抗砷基因的具有广泛寄主范围的hlcQ质粒pSDRAI，利用喜温硫杆菌的遗传转移系统，将pSDRAl接合转移到喜温硫杆菌中，同野生型喜温硫杆菌相比较抗砷基因工程菌的抗砷性能获得了明显提高．将构建的工程菌在以So，K2s406及Na2S203为能源培养基中进行抗砷性能表达研究，结果表明工程菌抗NaAs02的最高浓度，在Starlo／

5、-So无机盐培养基或Starky-Na2S203无机盐培养基可达到30mM，在Starky-Kz$406无机盐培养基中可达35mM．发现经遗传改造后的A．caldus在以K2S406作为能源物质对，生长状况最好，抗砷能力也进一步得到提高．关键词：喜温硫杆菌，遗传转移系统，抗砷基因工程菌山东大学硕士学位论文AbstractThestrainofAcidithiobacilluscalduswasisolatedin1994．Itisagram-negative，extremelyaeidophilicobli

6、gatelyautotrophicbacterium．IthasbeenusedindustriallyinmetalleachingfrommineraloresandinmicrobialdesulfurizationofcoalincombinationwithAcidithiobacillusferrooxidans．However，thedrawbacksoftheslowgrowthrate,thelowcellyield,andthesensitivitytoheavymetalshaveli

7、miteditsfurtheruse．SoitisnecessarytoimproveAcidithiobacilluscaldus,usingthemethodofrecombinantgenetechnology．Firstly,theplasmidsRP4andR69．45belongingto位broad-host-rangeIncPwcretransferredtoA．caldusfromEscherichiacoliusingconjugation1Ⅳiththegeneticmarkerofk

8、anarnycinresistanceexpressedinA．caldus．ThePlasmidsRP4andR68．45weretransferredbacktoE．colifromA．caldus．Thebroad-host-rangeIncQvectorofpJRD215wasmobilizedto彳．calduswiththeaidofplasmidRP4ortheplasmidRP4integrate