大肠杆菌ppk基因缺失工程菌的构建及其生物学特性研究

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1、分类号X172学号1203240500西要政旄科裁丈#学位论文大肠杆菌ppk基因缺失工程菌的构建及其生物学特性研究作者周国标指导教师姓名袁林江教授南亚萍讲师申请学位级别硕士专#名称环境科学与工程论文提交日期2015.06论文答辩日期2015.06学位授予单位答辩委员会主席刘转年评阅人刘转年卜龙利声明木人郑重声明我所呈交的学位论文是我个人在异师指导下进行的研究工作及収得的研究成果。尽我所知，除了文中已经标明引川的内矜外，本论文不包含其他个人或集体己经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人或其他人在其它单位Li中请学位或为其它用途使用过的成»。与我一同工作的冋志对本研

2、究所做的所有贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了致谢。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。论文作者签名：关于学位论文使用授权的说明本人完全了解西安建筑科技大学有关保留、使川学位论文的规定，即.•学校YT权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版，允许论文被査阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内鞞，可以采川影印、缩印或芥几它父制手段保存学位论文。(保密的论文在论文解密后应遵守此规定）论文作者签名：指导教师签名：jf丨期：^rj本人授权屮丨顏学术期刊（光盘版）杂忐社、屮圆科$技术佶息研究所等中位将木学位论文收录到有关“学位论

3、文数据庠”之中，并通过网络向社会公众提供信息服务。闽某种特殊原因耑要延迟发布学位论文电子版，冋意在k/-印/□两屯/□三年以后,在网络上全文发布。（此卢明处不勾选的，默认为即时公开)论文作者签名：指导教师签名^曰期：•么7注：请将此页附在论文首页。西安建筑科技大学硕士学位论文大肠杆菌ppk基因缺失工程菌的构建及其生物学特性研究专业：环境科学与工程硕士生：周国标指导老师：袁林江教授南亚萍讲师摘要在生物除磷的研究中，人们多侧重于除磷生物类群和生化代谢机理的研究，并试图通过改变工艺和环境条件等以解决除磷系统稳定性与高效性的问题。生物除磷是一个微生物主导的过程，微生物活

4、性的发挥需要依靠其体内基因调控。多聚磷酸盐（poly-P）是微生物与外部环境之间进行磷迁移转化的关键，而与其密切相关的调控基因是ppk基因。然而，关于生物聚磷现象的基因调控机制的相关研究还很少，已有的报道也存在各种矛盾。本研究以代谢工程理论为指导，运用“Red同源重组”技术敲除大肠杆菌ppk基因构建ppk基因缺失工程菌，并对其在不同条件下的生物学特性进行研究，旨在探明ppk基因的生物学功能。通过研究，得到以下结果：1.针对pKD4质粒和大肠杆菌ppk基因的上游和下游序列设计引物F-kan/R-kan，以pKD4质粒为模板，探索出扩增条件为：94℃预变性1min；

5、94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环；72℃再延伸10min下可成功扩增得到外源线性靶基因片段，片段长度为1613bp。2.当L-阿拉伯糖浓度为15mmol/L时，可诱导pKD46质粒表达Exo、Beta、Gam重组酶；在电击电压为1.8kv时可将外源线性靶基因片段导入目标菌菌体内并在重组酶作用下成功替换ppk基因。3.为避免假阳性现象影响工程菌的筛选，设计正向引物purn-F/ppx-R和反向引物p-F/p-R对工程菌的构建进行检验。正向引物PCR扩增后的结果显示野生菌、重组菌和工程菌可分别获得2464bps、2012bps和63

6、5bps的扩增产物；反向引物PCR扩增后的结果显示野生菌可获得约为1200bps的扩增产物，而重组菌和工程菌因基因替换或删除而无法获得扩增产物。通过序列分析可以断定ppk基因缺失工程菌已成功构建并在操作位点上未留下任何抗性基因的选择性标志。西安建筑科技大学硕士学位论文4.与野生菌相比，ppk基因的缺失并未影响工程菌的稳定传代和细胞形态。5.ppk基因的缺失可能引起RpoS蛋白或者IbeR蛋白表达受限，影响工程菌在培养初期能量物质的合成与贮存，致使在生长稳定期之前，野生菌和工程菌的生长状况没有明显差异，而当进入稳定期后工程菌较野生菌生长劣势。从聚磷角度分析工程菌相

7、对野生菌并未因ppk基因的缺失而影响其聚磷性能。论文认为其他基因可能代偿该基因的部分功能，致使以不同的方式保证其能量代谢的稳定性。生物摄磷现象是一个由多个基因共同调控的复杂的过程。关键词：Red同源重组；ppk基因；工程菌；聚磷；生物学特性资助来源：国家自然科学基金青年科学基金（No.51308440）西安建筑科技大学硕士学位论文KnockoutofppkGeneinE.coliandbiologicalfeaturesoftheMutantsSpecialty:EnvironmentalScienceandTechnologyName:ZhouGuobiaoI

8、nstructor:Pr