不同抗原负载人树突状细胞诱导特异性抗宫颈癌效应的实验研究

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2、手段保存论文和汇编本学位论文。f保密论文在解密后应遵守IIiIB_)论文作者签名：星堑导师签名：竺坠兰葺IJl．．一垡』丝山东大学博士学位论文不同抗原负载人树突状细胞诱导特异性抗宫颈癌效应的实验研究专业：妇产科学博士研究生：王华丽导师：孔北华中文摘要宫颈癌是发展中国家最常见的妇科恶性肿瘤。大量研究表明宫颈细胞学筛查有效降低了宫颈癌的发生率和死亡率。但是，发展中国家由于缺乏组织良好的普查计划，富颈癌仍是导致妇女癌症死亡的第二大原因。目前认为HPV感染是宫颈癌发生的始动因素。流行病学调查和分子生物学研究表明，宫颈癌发生与高危型人乳头状瘤病毒(如HPV16，

3、HPV一18，HPV一31等)感染密切相关，在99．7％以上的宫颈癌及其

4、j{『体病变(鳞状上皮内瘤变)中存在HPVDNA，并以HPV16最为常见，占50％。因此，HPvl6己成为宫颈癌疫苗的主要靶标。除了感染因素，免疫抑制是宫颈癌发展的另一个重要因素。研究表明，在肾移植、HIV感染等免疫抑制的妇女，宫颈癌的危险性明显升高。近年来，以免疫治疗和基因治疗为代表的生物治疗作为肿瘤治疗的第四种模式日益受到重视，作为宫颈癌治疗的重要辅助手段之一，生物治疗已逐渐显示出其独特的优越性。肿瘤的细胞免疫主要是T细胞免疫，依赖于有效的抗原递呈。树突状细胞是体内唯一能够激

5、活初始型T细胞的抗原递呈细胞，是启动、调控并维持免疫应答的中心环节，因此利用DC在患者体内建立起肿瘤特异的、持久的免疫应答，是目前将DC肿瘤疫苗用于治疗恶性肿瘤的基础，也是一种有应用前景的肿瘤免疫治疗的新方法。严重联合免疫缺陷鼠一SCID鼠同时缺乏T细胞和B细胞，可以用人类免疫细胞进行免疫功能重建，适合于在动物体内研究人类免疫细胞和人类肿瘤的关系，是理想的肿瘤及免疫功能重建的动物模型，为进一步研究HPVl6阳性的宫颈癌免山东大学博士学位论文疫治疗尤其是DC疫苗研究提供有价值的动物模型。由此我们设想如果通过树突状细胞摄取HPVl6相关抗原，那么由它诱导的

6、CTL是否可对HPVl6阳性的宫颈癌细胞产生特异性的杀伤活性。因此本实验首先探讨DC在抗肿瘤免疫中发挥作用，除了依靠其抗原递呈功能外，是否本身也可作为效应细胞来直接杀伤或抑制肿瘤的生长，然后设计了不同形式的抗原负载DC观察其诱导的CTL体外抗宫颈癌免疫效应，并在免疫重建荷人宫颈癌CaSki细胞重症联合免疫缺陷(SCID)鼠动物模型中观察负载HPVl6E7多肽的树突状细胞疫苗对移植瘤的影响。第一部分人外周血及脐血来源树突状细胞对宫颈癌细胞的直接杀伤效应目的：探讨人外周血及脐血来源树突状细胞(DC)的生物学特性及其对宫颈癌细胞的直接杀伤效应。方法：自外周血

7、及脐血分离获得单核细胞，体外经人重组细胞因子rhGM～CSF、rhIL一4和rhTNF—q诱导培养，获得DC，观察细胞形态，采用流式细胞仪(FCM)检测DC相关表型；MTT法检测人外周血及脐血来源DC对宫颈癌细胞Hela及CaSki的体外直接杀伤效应。结果：人外周血及脐血来源单核细胞诱导培养第6天后具有典型DC形态，FCM结果显示高表达HLA．DR(分别为99．29％矛E198．14％)、CD86(分别为99．45％和90．92％)和CD209(分别为87．44％和83．14％)，而CDl4表达率较低(分别为0％和3．32％)；抑瘤实验显示人外周血及脐

8、血来源DC在效靶比20：1、10：1和5：l时，对宫颈癌细胞Hela及CaSki均有明显杀伤效应(10％以上)，最高可达39．97％。结论：人外周血及脐血来源DC对人宫颈癌细胞具有直接杀伤效应，两者具有相似的生物学特性，本结论为DC在肿瘤免疫治疗中的作用提供了新思路。关键词树突状细胞；外周血；脐带血；宫颈肿瘤；肿瘤杀伤活性山东人学

9、尊十学位论文第二部分不同抗原负载人树突状细胞诱导特异性抗宫颈癌效应的体外研究目的：研究负载不同抗原的树突状细胞(Dc)诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)体外杀伤宫颈癌细胞的细胞毒性效应。方法：制备重组HPVl6E7蛋白、合成H

10、PVl6E749’57多肽和含有CpG基序的寡脱氧核苷酸(CpO—ODN)作为不同的抗原，自人