增强树突状细胞及其相关exosome抗肝癌免疫效应的实验研究

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1、天津医科大学博士学位论文中文摘要肝细胞肝癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)的临床治疗效果较差，研究者不断探索有效的治疗方法以期减少术后复发、延长生存时间、提高总体疗效。随着免疫学等基础研究的不断深入，生物治疗日益显示出良好的应用前景。作为肿瘤生物治疗策略之一的树突状细胞(dendriticcell，DC)疫苗的研究与应用已取得相当大的进展。然而在实际应用中DC疫苗的治疗效果往往不如预期，为此，众多学者尝试多种途经增强DC诱导的肿瘤特异性免疫反应，这其中包括对不同来源DC的比较和选

2、择，联合其他辅助药物如中药、多种细胞因子，以及研制新型亚细胞瘤苗exosome等来调节或替代DC功能。Exosome是肿瘤细胞和DC均能分泌一种膜性微囊结构，其重要特性是携带来源细胞的各种功能蛋白，且理化性质稳定、耐高温、制备时易于质控，已经在黑色素瘤、肺癌等的治疗中取得良好效果，用于抗肝癌的研究尚处于探索阶段。本课题尝试应用多种来源的单核细胞作为前体制各DC疫苗，又分别制备人肝癌细胞株SMMC7721来源(Tumor-derivedexosome，Texo)和DC来源的exosome(DC．derive

3、dexosome．Dexo)，研究其对抗肝癌免疫的诱导及调节效应，并初步探讨了中药单体黄芪甲苷对DC及其相关exosome诱导特异性抗肿瘤免疫的调节作用，为研制更具临床应用前景的用于肝癌的肿瘤疫苗和提高其治疗效果提供更多选择。目的1．应用多种来源的单核细胞，通过简便有效的方法，体外诱导培养获得足够数量及具成熟表型的DC，为DC疫苗的进一步研究及应用打下基础；2．对比分析Texo和Dexo的形态、表型及功能，研究此新型亚细胞瘤苗在抗肝癌免疫中的作用；3．观察中药单体黄芪甲苷(AstragalosideIV，

4、ASI)对于DC及其exosome免疫功能的调节作用，探讨其作为免疫增强剂的可行性。方法1．提取健康人外周血、人脐血及肝癌患者术中失血的单核细胞，用细胞因子组合rhGM—CSF、rhlL．4和TNF．Ⅸ诱导培养DC，光镜、电镜观察形态，流式细胞仪鉴定其表型；2．离心／超滤／超离法提取SMMC7721来源exosome(Texo)及SMMC7721抗原致敏DC来源的exosome(Dexo)，电镜观察，Western．blot检测其携带的蛋白；观察二者刺激淋巴细胞增殖情况，ELISA检测淋巴细胞培养上清中I

5、L．2，MTT法检测不同组合激活的效应淋巴细胞对SMMC．7721的细胞毒效应。3．在DC诱导培养过程中加入ASI，光镜及电镜观察细胞形态，流式细胞仪检测DC表型，ELISA法测定培养上清中IL．12和MHC天津医科大学博士学位论文II类分子水平；观察黄芪甲苷对DC刺激淋巴细胞增殖的影响；MTT法测定黄芪甲苷作用下DC及Dexo诱导的CTL对SMMC7721特异性杀伤效应。结果1．三种来源的单核细胞均可体外诱导培养为具有典型形态和表型的DC；术中失血来源DC表面标志物表达水平稍低，但较未诱导前有显著的提高

6、。2．应用少量细胞培养上清(60～80mL)提取exosome；Dexo和Texo具有相似的形态特征；前者表达CD40、CD80、CD8l、CD86、CD54、MHCI、MHCII(HLA．DR)；而后者CD40缺乏，CD80、CD86和MHCII(HLA．DR)相对低表达；二者在DC参与下均可显著刺激淋巴细胞增殖及IL一2分泌，且能激发较强的针对SMMC7721的特异性细胞毒作用，效果高于致敏DC组(尸<0．05)：Dexo具有刺激淋巴细胞活化增殖的作用，并可诱导具有特异性杀伤活性的CTL，杀伤效率(％

7、)明显高于单纯Texo(30．934-11．1VS10．244-7．37，P=0．004)，但低于致敏DC组(30．934-11．1％VS43．764-8．93％；P=0．050)。3．黄芪甲苷作用下DC生长状态及形态特征较常规诱导组无明显差异；各表面标志较常规诱导组均有不同程度上调，其中CD83表达显著上调(73．5％VS41．3％)：DC培养上清IL．12含量(pg／mL)较常规诱导组明显升高(632．654-14．26VS442．854-38．96，P=0．000)，且该组DC刺激淋巴细胞增殖作用增

8、强；黄芪甲苷可使未成熟DC释放exosome增加，并可促进DC诱导的CTL对SMMC7721的特异性杀伤(％)(59．98士5．23VS46．50-4-2．31，P=0．002)，而对Dexo无明显作用。结论1．健康人外周血、脐血和肝癌病人术中失血来源单核细胞均可在体外诱导获得具有典型形态和表型的成熟DC，用于后续肝癌DC疫苗实验研究；肝癌术中失血来源DC成熟度稍低，但有望通过体外诱导培养并添加促成熟因子提高肝癌患者DC成熟标