PPAR-γ配体对氧化应激诱导大鼠心肌炎症反应的抑制效应及相关分子机制的研究

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1、中国医学科学院北京协和医学院博l：论文PPAR-7配体对氧化应激诱导大鼠心肌炎症反应的抑制效应及相关分子机制的研究中文摘要目的：第一部分：采用氧化剂H202模拟氧自由基刺激大鼠心肌细胞，建立氧化应激诱导心肌细胞炎症反应的损伤模型。以体外原代培养的新生大鼠心室肌细胞为模型，从细胞生物学方面观察H202对心肌细胞的损伤效应。第二部分：在第一部分的基础上，探讨过氧化物酶增殖体活化受体吖(PPAR-一、／)配体在调节氧化应激诱导心肌炎症反应中的作用及可能的细胞保护机制。方法：第一部分：用机械解离法和酶消化法分离培养新生大鼠心室肌细胞，采用差速贴壁分离技术和化学药物抑制法进行纯化。倒置相差显

2、微镜下动态观察细胞形态，台盼蓝染色法测定细胞存活率，并用免疫荧光细胞化学技术鉴定心肌细胞纯度。M1vr法检测不同浓度H202对新生大鼠心肌细胞活力的影响。采用缩时录像机8050对培养的心肌细胞动态进行录像，采集搏动图像，观察搏动情况并计数搏动频率。第二部分：第一部分的基础上，观察H202在不影响心肌细胞活性的作用浓度下(100pmol／L)诱导细胞分泌炎症介质的效应。采用RT-PCR检测目标炎性因子TNF．a与LIXmRNA水平的表达：ELISA检测细胞培养上清液中TNF．(It蛋白含量；WesternBlot检测胞浆中LIX和Ir,Ba表达水平。观察PPAR-1"的天然配体15d

3、．PGJ2与合成配体吡格列酮对TNF．a与LIX表达的影响。利用电泳迁移率变动分析(EMSA)检测H202对核转录因子NF．r,B的效应；WesternBlot检测H202处理组胞浆中Ir,．Ba蛋白水平，以及PPAR吖配体对H202处理后胞浆中Ir,Ba蛋白表达的影响。同时采用EMSA技术检测15d．PGJ2与吡格列酮对H202诱导NF．1出活化的影响；15d．PGJ2和吡格列酮以及H202对心肌细胞内热休克转录因子HSFlDNA结合活性的影响以及与NF．r,B信号通路的关系。结果：第一部分：(1)成功地分离培养原代新生大鼠心室肌细胞，细胞存活率95％以上；差速贴壁分离后，倒置显

4、微镜下观察贴壁后心肌细胞呈梭形、菱形或多中国医学科学院北京协和医学院博上论文角形。8h后即可观察到部分心肌细胞自发性搏动，24h后心肌细胞己全部贴壁，90％以上搏动，48h心肌细胞聚集成簇，细胞搏动趋向同步化。免疫荧光染色鉴定心肌细胞来源及细胞纯度达95％以上，并可见心肌特异性横纹结构。(2)正常培养条件下，在两周不同培养时间内心肌细胞的搏动频率无统计学差异，表明在观察期限内心肌细胞活力保持不变。(3)不同浓度H202作用心肌细胞48h后，MTT检测的结果显示，109mol／L和509mol／L的H202对心肌细胞活性无影响。1001．tmol／L的H202轻微抑制心肌细胞的活性，

5、但无显著性差异(尸>O．05)。2001．tmol／L的H202明显抑制心肌细胞活性，具有统计学意义(尸<0．05)。(4)通过采集的搏动图像，观察并记录各处理组心肌细胞的搏动频率后统计结果显示，100tmaol／LH202作用后48h内，对心肌细胞搏动频率无明显影响(尸>O．05)，2001maol／L的H202作用4h后，即显著抑制心肌细胞的搏动频率(氏O．05)，并随时问的延长其抑制效应明显增强(P<0．01)。第二部分：(1)100Imaol／LH202作用心肌细胞30min后，炎症介质TNF吨和LⅨ表达开始升高，4h达到峰值后逐渐下降。NF—r,B特异性抑制剂SN50明显

6、抑制H202诱导TNF．a和LIX的生成(P<0．05)。(2)100Imaol／LH202呈时间依赖性地激活NF．r,B，4h时活化达到高峰值(P<0．01)，至8h时逐渐降低(P

7、白水平(尸