cd36对lps诱导的自噬和炎症因子的影响及分子机制研究

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1、SOOCHOWUNIVERSITY硕士学位论文指导教师姓名专业名称病原生物学研究方向感染与免疫2015年4月论文提交日期苏州大学学位论文独创性声明本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得苏州大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本声明的法律责任。论文作者签名：Mm日期：一5、}S苏州大学学

2、位论文使用授权声明本人完全了解苏州大学关于收集、保存和使用学位论文的规定，即：学位论文著作权归属苏州大学。本学位论文电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。苏州大学有权向国家图书馆、中国社科院文献信息情报中心、中国科学技术信息研究所（含万方数据电子出版社）、中国学术期刊（光盘版）电子杂志社送交本学位论文的复印件和电子文档，允许论文被查阅和借阅，可以釆用影印、缩印或其他复制手段保存和汇编学位论文，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索。涉密论文口本学位论文属在—一年一月解密后适用本规定。

3、非涉密论文论文作者签名：•!§)日期：一^016^sl5导师签名：日期：•i.CD36对LPS诱导的自噬和炎症因子的影响及分子机制研究中文摘要中文摘要目的：革兰阴性菌内毒素—脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）是其细胞壁结构组分，当细菌死亡裂解时游离出来发挥毒性作用。CD36作为一种模式识别受体（patternrecognitionreceptor，PRR）可介导细胞识别LPS等多种抗原，由于其特殊的跨膜结构，还具有介导信号通路和调节细胞功能等作用；CD36的泛素化能快速调节其在

4、细胞膜上的含量并影响其自身功能，因此藉用CD36泛素化位点的突变可考察泛素化对其功能的影响。巨噬细胞（macrophage）是机体重要的免疫细胞，也是炎症反应的主要参与者。LPS能有效地诱导巨噬细胞分泌TNF-α和IL-6等炎症因子，亦可诱导细胞自噬等反应参与抗感染免疫。CD36作为一种重要的PRR，在巨噬细胞中亦有丰富的表达，而对其在LPS诱导的巨噬细胞自噬和炎症因子分泌中的影响及分子机制研究甚少；CD36泛素化对其介导的信号通路和细胞功能有何影响尚待研究。野生型中国仓鼠卵巢细胞（Chinese

5、hamsterovarycell，CHO）无CD36的天然表达，同时该细胞还具有高扩增和表达特点，因此本课题第一部分以LPS与稳定转染空质粒、野生型cd36基因和泛素化位点突变cd36基因的CHO细胞（CHO/Vector、CHO/CD36WT和CHO/CD36K/A）共作用,探讨CD36及其泛素化对LPS诱导的丝裂原活化蛋白激酶（Mitogenactivatedproteinkinase，MAPK）信号通路和自噬的影响。第二部分首先利用siRNA和ERK抑制剂干预手段处理鼠源巨噬细胞RAW264

6、.7，通过建立LPS与不同条件预处理的巨噬细胞RAW264.7共作用为细胞模型，研究巨噬细胞中CD36对LPS诱导的自噬和炎症因子分泌的影响及分子机制，为阐明CD36对LPS诱导的自噬和炎症因子分泌的影响及分子机制提供理论和实验依据。方法：一、CD36及其泛素化对MAPK信号通路及自噬的影响1.LPS与CHO细胞共作用适宜浓度和时间的确定本实验分别以0、5、10、20、50、100、200、500、1000ng/mlLPS与CHO/CD36I中文摘要CD36对LPS诱导的自噬和炎症因子的影响及分子

7、机制研究WT细胞共作用相同时间后收集细胞；进而将100ng/mlLPS与CHO/CD36WT细胞分别共作用0、10、30、60、120、240min后收集细胞。采用蛋白质印迹技术（westernblot，WB）检测上述所收集细胞中ERK磷酸化水平，以确定LPS与CHO细胞共作用适宜的浓度和时间。2.CD36及其泛素化对MAPK信号通路的影响MAPK信号通路参与细胞中多种生理病理过程并发挥着重要作用。在MAPK家族中细胞外调节蛋白激酶（Extracellularregulatedproteinkin

8、ase，ERK）、c-Jun氨基末端激酶（c-JunN-terminalkinase，JNK）和p38是研究最广泛和最重要的蛋白激酶，其磷酸化水平高低决定了其活性程度。实验分别设置LPS与CHO/Vector、CHO/CD36WT和CHO/CD36K/A细胞共作用的组份及相应的未加LPS作用的阴性对照组，共6组。根据上述实验确定的LPS工作条件，以100ng/mlLPS作用细胞2h后，WB检测ERK、JNK和p38磷酸化水平，即ERK、JNK和p38的活性。3.CD36及其泛素化对