Flt1在小细胞肺癌细胞穿过人脑微血管内皮细胞单层中的作用及机制研究

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1、·中文论著摘要·Fit．1在小细胞肺癌细胞穿过人脑微血管内皮细胞单层中的作用及机制的研究目的脑部肿瘤严重危害人类的健康，以继发性脑瘤为主。肺癌为癌症的首要杀手，小细胞肺癌(smallcelllungcancer，SCLC)为临床常见的恶性肿瘤，生长快，侵袭力强，易发生胸内或远端转移，近一半的SCLC患者会发生脑转移【l】，SCLC发生脑转移是导致这类疾病死亡的主要原因。脑转移的关键步骤是小细胞肺癌从血液中游离出跨血脑屏障(Bloodbrainbarrier，BBB)进入脑组织。血脑屏障是位于脑组织与血液之间的一个复杂细胞系统，血脑屏障的物质基础是脑部的微

2、血管，脑微血管内皮细胞间的紧密连接(tightjunction，TJ)使得血管内皮细胞间相互“焊接”得十分紧密，不象其他组织微血管壁那样有较大的缝隙，对于保护脑组织周围稳定的生理环境和防止血液中有害物质侵入脑内具有重要的生理意义。紧密连接由许多蛋白构成，完整的紧密连接结构蛋白主要由跨膜蛋白、胞质附着蛋白和细胞骨架(微丝)三种组分构成。跨膜蛋白如occludin、claudins和连接粘附分子(junctionaladhesivemolecule，JAM)等，为跨膜糖蛋白，参与封锁相邻细胞间的空隙；胞质附着蛋白如ZO．1、ZO．2和ZO．3等，ZO为紧密连

3、接处的膜外周蛋白，将occludin与其下面的actin骨架相连【2．8】。这些蛋白附着到细胞骨架上，彼此相互作用【9'101，参与维持和调节紧密连接的屏障功能。多种机制参与调节细胞间TJ的功能，occludin蛋白的高度磷酸化在TJ结构的组装和功能的调节上起到重要的作用。膜周边蛋白ZO．1将跨膜蛋白occludin和actin骨架纤维相连，actin既是细胞间TJ结构组分，又是TJ渗透性的调节者。一些调控actin骨架纤维组装的信号分子也与TJ渗透性功能的调节相关。小GTP结合蛋白RhoA为公认的actin骨架纤维的调节者，我们实验室最近的研究表明：小

4、细胞肺癌细胞(NCI．H209细胞)能够通过内皮细胞的Rho／ROCK信号通路指导其跨过人脑微血管内皮细胞(HBMEC)单层迁移【74】，但有关其穿过HBMEC单层的详细机制尚未清楚。血管内皮生长因子(Vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)又称为血管渗透因子，其蛋白家族包括VEGF—A，B，C，D和胎盘生长因子(Placentalgrowthfactor，PIGF)。P1GF为分泌的糖蛋白，与VEGF在氨基酸序列残基上有53％的同源性，且其生物学功能与VEGF也有相似之处，如刺激内皮细胞生长等n卜161。血管内皮生长因

5、子受体1(Vascularendothelialgrowthfactorreceper,VEGFR-1，又称为Fms·liketyrosinekinase·1，Fit-1)，为P1GF在细胞膜上的专一受体，属于受体酪氨酸激酶家族成员，由七个免疫球蛋白样结构的胞外区、跨膜区、近膜区、激酶插入区和C．末端构成。PIGF与Fit-1的胞外区结合后，可活化受体的酪氨酸激酶，活化的酪氨酸激酶在信号转导的传递和生物学功能的发挥中起到重要的作用。本实验室通过免疫组化技术检测到小细胞肺癌细胞高表达P1GF，并证实P1GF在小细胞肺癌细胞跨人脑微血管内皮细胞单层迁移过程中

6、发挥作用，但有关PIGF的受体Flt．1在这一过程中所发挥的作用及机制尚不清楚，本研究试图回答该问题。方法一、探讨Fit．1受体在小细胞肺癌细胞跨人脑微血管内皮细胞单层迁移中的作用l、细胞培养(1)HBMEC细胞培养于含10％胎牛血清和10％Nu血清的RPMll640培养液(2)NCI．H209细胞培养于含10％新生牛血清的RPMll640培养液2、免疫荧光技术观察NCI-H209细胞与HBMEC单层共培养后内皮细胞间TJ结构改变3、蛋白抽提和Westernblot方法分析NCI-H209细胞与HBMEC单层共培养后TJ蛋白occludin的可溶性片段和

7、不可溶性片段的分布情况24、跨内皮迁移实验分析NCI．H209细胞与HBMEC单层共培养后其跨HBMEC单层迁移能力5、HRPflux检测分析NCI．H209细胞与HBMEC单层共培养后HBMEC单层渗透性改变6、Westernblot方法检测NCI．H209细胞与HBMEC单层共培养后Flt．1蛋白表达情况7、中和抗体及抑制剂封闭实验利用Fit．1中和抗体和VEGFR．1、2受体抑制剂，分析Fit．1受体及其磷酸化形式在NCI．H209细胞的跨内皮单层迁移中的作用8、建立和培养稳定干扰Flt-1的HBMECs并检测其与NCI．H209细胞共培养后相关生

8、物学特性的变化二、探讨Rho／ROCK信号通路通过Fit．1受体启动小细胞肺癌细