马铃薯Y病毒衣壳蛋白基因片段长度和结构对RNA介导抗病性的影响

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1、山东农业大学博士学位论文马铃薯Y病毒衣壳蛋白基因片段长度和结构对RNA介导抗病性的影响姓名：朱俊华申请学位级别：博士专业：植物病理学指导教师：温孚江2003.5.24关于学位论文原创性和使用授权的声明本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学研究所取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和做出重要贡献的个人或集体，均在文中明确说明。本声明的法律责任由本人承担。本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规定，同意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸质本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采

2、用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。保密论文在解密后应遵守此规定。论文作者签名：丝竿一导师签名：五蚴f∥、9而日期：堕占马铃薯Y痰毒衣壳虽爨基医，跨段长度释续构慰RNA奔导撬病性鼹澎嚷摘要，j马铃薯Y病毒(PotatovirusY，PVY)在世界范围内引起马铃薯、烟草等重要经济作物的病害，每年均造成严重的经济损失。掰翦利用抗病毒基因工程培育抗瘸檀株是一条极熊潜力的防治植物病毒瘸害的途径。在植物抗病海基因工程中，发现一种新的策略为RNA介导的抗病性(RNA—mediatedvirusresistance。RMvR)。RNA介导的抗病性具有抗病耩度高、抗往持久及生物安全谴离等

3、优点，但存在抗病谱窄的缺点。目前已证硝RNA介导的抗病蚀是RNA沉默(RNASilencing)的结果。RNA介导的抗瘸程度依赖于转基函片段的长凄耘结构。j。—7一本研究是在已证明转化全长马铃薯Y病毒坏死株系农壳蛋囱基因(PVY“-CP)可获得褰获PrY戆转纂蠢疆撩、盈迂鞠这耱揍豫为RNA奔零抗瘸缝基鹚主，进～步磷究转基西片段的长度和结构对RNA介导抗病性的影响。即转化马铃薯Y病毒坏死株系衣壳强白基因(P￥￥Le}))3’璐417bp(1／2cP)襄603bp(3／4CP)鑫孽部分蕊嚣冀羧(e融l?察CP603)，疆寻找高抗PVY转基因植株所需CP基因缀短有效长度的cDNA片段。另外，将

4、马铃薯Y癍毒坯恁抹系(PVY”)郝努农壳爨鑫基黢设诗残疲惫重笈(IR)秽正囊黧复(豫>．}挚到，以研究转基因酌结构对RNA介导的抗病性的影响。这一研究结果对改进利用转录后基因沉默策赡来防治植物病毒病害以及探讨PTGS产艇鲍枫剁都具鸯十分重要熬意义，著戈今后开臌多抗植物病毒遗传育种奠定基础。俱体结果如下：、l。马铃薯￥病毒衣壳蛋自基觳片段长度对RNA介嚣撬瘸性的影镌1．1根据本实验室已克隆的PVr全长cP的cDNA序列(804bp)，设计了pVyN-cp3’壤部分基嚣片段(CP4i7帮CP603)豹稔雾弓l物，竣pVyN-cp豹cDNA凳搂板，遴行PCR扩增，得到长为417bp(1／2CP

5、)和603bp(3／4CP)的部分农壳蛋白基因扩增产物(CP417粒CP603)，缝必籍用B戳itI窝KpnI双酶饶，与翱圈酶处理豹pBSK连接，热激法转纯丈肠杆菌，筛选并获得重组克隆质粒pBSK—CP417和pBSK—CP603，对重组克隆质粒进行序列测定，表明我嬲已成功缝支隆爨pVy”-cp3’蠛417bp秘603bp豹基因砖段。弱Bali和Kpnl从重组克隆载体上切下目的基因片段，插入到植物双元表达载体pROKII的Bali和Kpnl憾点之间，酶切黢定表明构建了棱物表达载体pROK-CP417和pROK—CP603。1．2将构建成功的植物表达载体利用冻融法直接导入农杆菌LBA440

6、4，PCR及酶切豁定证明质粒均融成功导入农杆麓菌株，可用于烟草转化。I．3许盘法转纯烟草NC89。经卡酃霉素对褥生植株再次抗住筛选、PCR检测，表明转化CP417共获得224株(To代)转基因植株，转化CP603共获得77株(T8代)转熬因檀撩。‘1．4转基因植株的抗病性分析表明，以PVY“的病汁液为接种物，汁液摩擦接种转4些叠奎些查堂堂主堂垡迨塞———基因烟草。症状观察及ELISA检测袋明转基因烟草有三种不同的抗性反应：类型I为感病型(Susceptible，s)，类型ll为推迟发病型(Delayed，D)，类型III为抗病型(Resistant，R)或免疫。獒中，在224株转化CP4

7、17的转基因烟擎中有24株为D型，比例为10。7％；19株为R型，比例为8．48％；在77株转化CP603的转基因烟草中有6株为D型，比例为7．8Y,；8株为R蘩，眈铡为lO．4％。表瞬转化CP417帮CP603均可获得抗病程度运免疫的转基因檬株。缩合本实验室他人研究结果，表明转化PVY"-CP3’端202bp不能获褥撬瘸程发达免疫鹩转基因禳秣，霹知能蟹诱发RNA奔导挠瘸性所需靛PVY"-CP基闲的最短有效片段长度位于202bp和4