马铃薯y病毒及水稻黑条矮缩病毒cp基因不同区段对发夹rna介导的病毒抗性影响

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1、山东农业大学博士学位论文马铃薯Y病毒及水稻黑条矮缩病毒CP基因不同区段对发夹RNA介导的病毒抗性影响姓名：吴斌申请学位级别：博士专业：植物病理学指导教师：温孚江；朱常香20120611尔农业人学I博lj学位沦文中文摘要RNA沉默是牛物抵御外来核酸入侵以保持牛物自身基因组完整性的一种高度保守的、序列特异的RNA降解机制，广泛存在于植物、动物、线虫和真菌等真核牛物中。RNA介导的病毒抗性(RNA．MediatedVirusResistance，RMVR)是近年来发展起来的一种新的抗病毒基因工程策略，它是以病毒核酸片段为转基因而诱导的转录后基因

2、沉默，具有抗病程度高、抗性持久及牛物安全性高等优点。在前期的研究中，人们发现并非所有符合条件的siRNA都同样有效，具体原因还不清楚，可能是“位置效应”(positioneffects)所致。本研究首先以马铃薯Y病毒(PotatovirusY，PVY)外壳蛋白基因(CP)不同区段50bp的序列为靶序列构建发夹RNA(hpRNA)结构的植物表达载体，系统性的比较PWCP基因不同区段对RNA介导的病毒抗性的影响。在此基础上，以水稻黑条矮缩病毒(Riceblackstreakeddwa矿virus，RBSDV)CP基因5’端、中间和3’端500

3、bp的序列为靶序列，构建hpRNAi植物表达载体，转化水稻，进一步比较了不同位置的靶序列对RNA介导的病毒抗性的影响，筛选获得了高抗RBSDV的转基因水稻新材料。研究结果对有效地选择靶位点序列和高效地应用RMVR策略培育抗病毒转基因植物具有重大指导意义。研究结果和丰要结论如下：1．马铃薯Y病毒CP基因不同区段对发夹RNA介导的病毒抗性的影响将PVYNCP(801bp)划分为长度为50bp的16个短片段，进而利用PCR技术扩增CP基因5’端8个目的片段，反向重复插入植物表达载体pROKII中，构建了具有hpRNA结构的植物表达载体pROK．

4、CPs(pROK．CPI～pROK．CP8)。将构建好的16个重组植物表达载体(3’端的8个载体由姜芳构建)利用冻融法导入农杆菌EHAl05，并瞬时侵染本牛烟以验证其有效性。Northernblot结果显示，16个植物表达载体不仪均能在植物体内成功表达产牛siRNA，而且瞬时表达的siRNA能对靶基因PVYCP的表达进行有效地下调。采用冻融法将构建成功的植物表达载体导入农杆菌LBA4404，叶盘法转化烟草NC89，经卡那霉素抗性筛选和PCR检测获得To代转基因植株。To代自交所获得的种子置于含卡那霉素的筛选培养基上进行筛选，选取抗性幼苗进

5、行温室移栽并进行PCR检测，结果表明，转化pROK．CPl～pROK．CP8分别获得60、55、70、66、66、48、68和72株TI代转基冈植株。以PvYN的病毒汁液为接种物，摩擦接种16个载体的转基因烟草(3’端的8个载体，5铃薯Y病毒及水稻黑条矮缩病毒CP基Iq不I司区段对hpRNA介导的病毒抗t5-影响的转基冈烟草由姜芳转化获得)，通过症状观察及ELISA检测进行抗病性分析发现，转化pROK—CPl～pROK．CP4所得的转基因植株抗性植株比例均为O％，而转化pROK．CP5～pROK—CPl6的转基因株系中抗性植株的比例分别为

6、27．15％、6．27％、67．65％、70．83％、66．01％、61．34％、66．04％、23．59％、11．11％、55．56％、77．78％和67．25％。结果表明，以CP基因37端为靶序列比以5’端为靶序列更能有效地介导对PVY的抗性。Tl代转基因植株的Northernblot杂交分析表明，转基因都在RNA水平上得到了表达，抗病植株中RNA的积累量明显低于同类型的感病植株，即抗性与RNA积累量呈负相关，同时，在所有转基因植株中均能检测到siRNA，表明植株对病毒的抗性是由RNA所介导的，但植株的抗病性与siRNA积累量之间没有

7、明显的相关性。对T2代的转基因植株的抗病性分析结果表明，由hpRNA介导的PvY抗性可以在T2代植株中稳定遗传。2．水稻黑条矮缩病毒CP基因不同区段对hpRNA介导的病毒抗性影响利用PCR技术扩增来自RBSDVCP5’端、中间和3’端长度为500bp(nt89-588，nt589．1088，ntl089—1588)片段，构建hpRNAi植物表达载体RBSDV-CP5。、RBSDV．CPM和RBSDV-CP3t，酶切鉴定表明植物表达载体构建成功。将构建好的三个重组表达载体利用冻融法导入农杆菌EHAl05中，采用农杆菌介导法转化镇稻88。转化

8、RBSDV-CP5’、RBSDV-CPM和RBSDV-CP3’的转基因植株，经除草剂和PCR检测，分别获得19、2l和22株To代转基因阳性植株。将To代自交结实后获得的Tl代转基因植株，利用