PVX+25kD运动蛋白基因和外壳蛋白基因介导的抗病性研究

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1、山东农业大学硕士学位论文PVX25kD运动蛋白基因和外壳蛋白基因介导的抗病性研究姓名：刘晓玲申请学位级别：硕士专业：植物病理学指导教师：温孚江20050618山东农业犬学硕士学位论文摘要利用病毒本身的基因获得抗病毒转基因植株，即源于病原物的抗病性(pathogen—derivedresistance，PDR)，’已经成为植物抗病毒基因工程育种的主要措旋之一。其中包括外壳蛋白(CP)基因、运动蛋白(MP)基因、复制酶基因以及病毒卫星RNA基因等多种策略。1993年Lindb0等又发现了RNA介导的病毒抗性，这种策略具有抗病程度高、抗性持久、生物安全性

2、高等特点，因此是一种具有较大潜在应用价值的植物抗病毒基因工程策略。PVX是马铃薯X病毒属的典型成员，常与其他病毒混合侵染往往导致马铃薯的毁灭性减产。目前，利用RNA介导的病毒抗性对PVX的研究极少。RNA介导的病毒抗性实际上是一种转录后基因沉默(posttranscriptionalgenesilencing，PTGS)。25KD运动蛋白便是一种PTGS的病毒抑制子。本研究以烟草为材料转化非翻译PVX．p25，通过沉默这种病毒抑制子来获得RNA水平上的高度抗性的转基因植株。并同时转非翻译的CP基因，探索二者的转基因植株抗病性是否有差异，为选择更有效

3、的基因片段转化植物，获得高抗性比例的高度抗病的转基因植株奠定基础。具体结果如下：1．分别克隆非翻译的PVX25KD运动蛋白基因与非翻译的PVXCP基因，构建植物双元表达载体pROKII．p25和pROKII-CP。2．将植物表达载体pROKII—p25和pROKII．CP利用冻融法直接导入农杆菌LBA4404。PCR及酶切鉴定证明质粒均已成功导入农杆菌菌株，可用于烟草转化。3．叶盘法转化烟草NC89。经卡那霉素对再生植株再次抗性筛选、PCR检测，表明共获得转非翻译PVX．p25的植株78株(To代)，转非翻译PVX．CP的植株83株(To代)。4．

4、转基因植株的抗病性分析：以PVX的病汁液为接种物，汁液摩擦接种转基因烟草。症状观察及ELISA检测表明不同的转基因植株对PVX的抗性比例存在着差异。在78株转PVX-p25的烟草中有3l株表现高度抗病，抗性比例为39．7％。在83株转PVX—CP的烟草中有ll株表现高度抗病，抗性比例为13．3％。5．分别选取抗病性表现不同(抗病和感病)的部分转基因植株提取总5PVX25kD运动蛋白基因和外壳蛋白基因介导的抗病性研究DNA进行Southernblot分析，分析转基因的拷贝数与抗病性问的关系。结果表明转基因的拷贝数与抗病性无明显的相关性。6．转基因植株

5、的Northerr{blot分析表明，转基因都在RNA水平上得到了表达，抗病性与转基因转录本的积累量二二者之间呈负相关，即这种抗病性为RNA介导的抗病性，为RNA沉默的结果。关键词马铃薯X病毒；运动蛋白；外壳蛋白；RNA介导的病毒抗性6山东农业大学硕士学位论文AbstractTransgenicplantsexpressingvirusgenesorsequenceshavebeenshowntoberesistanttOplantvirusinfections．Thisformofresistanceisknownaspathogen—deriv

6、edresistance(PDR)．ThereareseverMPDRstrategiessuchascoat，movementandreplicaseproteingenes，In1993LindboetalhavealsofoundRNAmediatedvirusresistance．Duetoitsadvantageofhighbit—safetyandeffect，theRNAmediatedvirusresistancehasbecomeahotspotintheareaofplantanti—virusgeneticengineerin

7、g．PVXisthetypicalmemberofPVXgenus．Frequently，itcoinfectswithotherplantvirusesanddecreasestheoutputofpotatoesenormously．Atpresent，therehasbeenlialereportonRNA—mediatedresistanceagainstPVX．Infact，RNAmediatedvirusresistancebelongstoposttranscriptionaigenesilencing(PTGS)．25KDmovem

8、entproteinisavirussuppressorofPTGS．Weheredescribethetransform