寄生疫霉Elicitin基因克隆、表达及Elicitin诱导植物抗病防卫的机制研究

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1、山东农业大学博士学位论文寄生疫霉Elicitin基因克隆、表达及Elicitin诱导植物抗病防卫的机制研究姓名：梁元存申请学位级别：博士专业：植物病理学指导教师：张天宇;董汉松2002.12.1缩写符号bpCTABDEPCdNTPEDTAITPGKDKmM—MLVORFPAGEPBSPCRPMSFRN船erpmrRNasinSDS1lisU英文缩略表英文名basepairhexadecyltrimethlammoniumbromidediethylpyrocarbonatedeoxyribonucIeosidetriphosphateethylenediaminetetracetic

2、acidisopmpyl-B—D·thiogalacmsidekilodaltonkanamycinmoloneymurineleukemiavirusopenreadingframepolyacrylamidegelelectrophoresisphosphate—bufferedsolutionpolymerasechainreactionphenylmethylsulfonylfluorideribonucleaserevolutionsperminuteribonucleaseinhibitorsodiumdodecylsufatetrishydryxymethylamino

3、methaneunit中文名碱基对溴化十六烷基三甲基胺焦碳酸二乙酯脱氧核糖核苷三磷酸乙二胺四乙酸异丙基一硫代一B-D-半乳糖干道尔顿卡那霉素莫洛尼鼠类白血病毒开放阅读框架聚丙烯酰胺凝胶电泳磷酸盐缓冲液聚合酶链式反应苯甲基磺酰氟RNA酶每分钟转速RNA酶抑制剂十二烷基硫酸钠三羟甲基氨基甲烷单位山东农业大学博士学位论文摘要Phytophthora和eythium的许多种能向细胞外分泌一类小分子量的蛋白质，统称为elicitins。Elicitins在烟草上能引起过敏反应(hypersensitiveresponse，HR)和系统获得抗性(systemicacquiredresistanc

4、e，SAR)。Elicitins．烟草互作体系是研究信号识别、信号传导等诸多问题的良好体系。本论文报告作者对烟草寄生疫霉(Phytophthoraparasiticavar．nicotianae)中国菌株的elicitin基因进行克隆、表达及其诱导植物抗病性方面的研究结果。根据己报道的寄生疫霉parAl基因的序列设计引物，从4株寄生疫霉不同寄主分离物(3株来自烟草，1株来自刺槐)中克隆到此基因，序列分析表明4株寄生疫霉parAl基因序列高度保守。然后研究了parAl在大肠杆菌(Escherichiacoli)中的表达。对表达载体pET30a(+)X2酶切(NdeI-BamHI)，构建

5、表达elicitin蛋白的表达载体pET．eli，用CaCl2法转化大肠杆菌BL21菌株，通过IPTG诱导在大肠杆菌中产生的蛋白在烟草上引起过敏性坏死反应。对重组蛋白性质测定表明，重组蛋白有一定的耐热性，并对蛋白酶K敏感。至此，我们已成功地从寄生疫霉中国菌株中克隆到了parAl基因，并建立了大肠杆菌重组表达体系。在获得重组蛋白的基础上，测定了其诱导烟草和番茄对真菌、细菌和病毒病的抗病诱导作用。对不同浓度的elicitin进行诱导作用比较，此重组蛋白在30nM时。喷洒诱导烟草后产生最高的抗TMV的诱导作用：诱导作用可维持至少20天，其中在第4—5天诱导效果最好。因此，在elicitin

6、诱导植物时，最好使用30nM浓度，并在诱导后第4-5天挑战接种可产生最大的诱导效果。用30nM的elicitin处理烟草和番茄，第4天接种测试的病原物，烟草经诱导后，烟草能抗TMV(tobaccomosaicvirus)、烟草黑胫病菌∽parasitica)、烟草赤星病菌似lternarialongipes)和烟草青枯病菌(neudomonassolanacearum)，诱导作用分别是74．1％、63．8％、50．6％}1145．0％：番茄经诱导处理后抗青枯病(户solanacearum)，诱导作用为43．1％。因此elicitin的抗病诱抗作用是非特异的。植物诱导抗性通常与过敏反应

7、(HR)及病程相关(PR)等基因的表达相关联，而这些反应受信号分子水杨酸的调控，在不同体系中，还有H202等信号分子及ca2+通路因子的参与。为了明确elicitin诱导HR的上游信号传导因子，对elicitin处理后梁元存；寄生疫霉Elicitla基因克隆、表达及Elicitin诱导植物抗病防卫的机制研究植株体内SA、H202的积累及c一+通道相关反应作了测定。烟草经elicitin诱导处理后，体内水杨酸含量比对照提高了1．65-2．88倍，其中在诱导后