辣椒疫霉效应分子编码基因的克隆及功能分析

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1、：－ｒ－－产＾支分类号今东Ｌ？带啼教獻斬＇学％Ｍ１２０８６Ｑ１、＇．？达芯－’心－密级．ＵＤＣ＿＿＿＾姆气讀：＾或＇隊争叫义葦賴＂务爸繁寒硕去学位冷文；參满，托（学术型）－心．；处．运‘，辣椒疫霉效应分子编码基酬克隆及功能分析賴＞＇‘玉川４：邢：為，合平．叫？乂卢＇＇指导教师姓名；童蕴慧教授，扬州大学，扬州大学，２２５００９＾２２５００９？陈牽仁副教授，扬州大学，扬州大学，气詳申请学位级别；硕ｄ：学科专业名称：植物病理学＾论文提交日期；２０１５年Ｓ月论文答辩日期；２０１５年５月３０日

2、．？ｆ．一学位授予单位：扬州大学学位授予日期：＾；＾ｉ一金＞＾答辩委员会主席－－：徐敬友教授（扬州大学）ｆ论文评阅人；董莎萌教授（南京农业大学）■＇二徐敬友教授（扬州大学）节＇、、＇．＇Ｖ公；斗－＊心若Ｖ辛乂护＇擇麵議哪終，輪礁聊参２０１５年５月＊＞？－５会＾每少：辣椒疫霉效应分子编码基因的克隆及功能分析摘要辣椒疫霉是一种寄主范围广的半活体营养型植物病原卵菌，常危害茄科、葫芦科和豆类等蔬菜的安全生产，。由于疫霉菌在进化上与真菌相差甚远现有的杀菌剂大多对植物疫一レ病防治无效，加么

3、品种抗病性利用尚不理想，直ッ来还没有有效的辣椒疫霉防控手段。，因此，在传统的防治措施之外从疫霉菌与植物互作的角度出发深入了解疫霉菌致病的分、子机理，对开发新的杀菌剂作用靴标设计植物疫病控制策略具有重要价值。本论文首先研究了辣椒疫霉在侵染前期差异表达的基因种类。通过对侵染前期Ｈ个关键阶段菌丝的转录组测序及生物信息学分析，９８个在这、游动抱子和萌发休止抱筛选出）（些阶段差异表达的效应分子编码基因，其中包含巧个ＲＸＬＲ、９个ＣＲＮ和化个日ｉｃｉｔｉｎ编码基因。ＲＴ－ＰＣＲ利用半定量技术，分析获得的效应分子编码基因在辣椒疫霉侵染阶段（

4、本巧烟接种后１．５、３、６、１２、２４、３６、７２ｈ和侵染前期阶段菌丝、游动抱子囊、游动抱子和萌发）（休止抱的表达水平。结果发现巧个基因在辣椒疫霉侵染本氏烟的过程中差异表达，包括）ＲＸＬＲ１２个、ＣＲ＾５个、別州ｉｎ１３个、ＰｃＦ／ＳＣＲ２个和ＮＬＰ３个基因。不同类型效应分（）＾）（）（）（）一子在侵染过程中的转录模式不同，同类型的不同效应分子的转录模式也存在差异。通过高保真扩增技术将这巧个侵染阶段差异表达的效应基因克隆到马铃薑Ｘ病毒（ＰｏｆａｔｏＷ／ＵＳ乂ＰＶＸ）表达载体中，利用农杆菌介导的瞬时表达法分析这些基因是否能够引

5、起ｔｒＰｌａｎｔｃｅｌｌｄｅａｔｈＰＣＤ。４日ｉｃｉｔｉｎ、１ＮＬＰ１ＲＸＬＲ本巧烟植物的细胞死，结果表明，个个Ｗ及个（）ＰＣＤ一效应分子均能诱导本氏烟的。为进步明确效应分子引起ＰＣＤ的功能区域，对其中的ＲＸＬＲ效应分子ＰｃＵＷ１３进行了缺失和替换突变分析，构建了１３个突变体。结果显示，第－－￣１和第２个ＷＹＬｄｏｍａｉｎ对其触发本氏烟ＰＣＤ的功能是必需的，第別３１２位氨基酸残基对’其维持触发ＰＣＤ的功能很重要。除上述６个基因之外，其余的基因不能诱导本氏烟产生ＰＣＤ。本研究分析了ＲＸＬＲ和ＣＲＮ效应分子对本氏烟Ｐ

6、ＣＤ的抑制情况，分析其是否具有毒性因子的作用。所选取的触发本氏烟ＰＣＤ的效应分子包括ＩＮＦ１、ＢＡＸ、ＰＳＣＲＮ６３、ＰｓｏＮＩＰ、ＰｓＡｖｈ２４１、Ｒ３ａ／ＡＶＲ３ａ。结果ｊ表明，大多数效应分子１５／１７具有抑制寄主植物ＰＣＤ的毒性功能。其中，效应分子中６４．７％＿（）能够抑制ＩＮＦ１所诱导的ＰＣＤ，８２．４％能够抑制ＢＡＸ诱导的ＰＣＤ７６．５％ＳＣＲＮ６３，能够抑制Ｐ诱导的ＰＣＤ，如．２％能够抑制ＰｓＡｖｈ２４１和ＰｓｏＮＩＰ所诱导的ＰＣＤ，而只有１７．６％能够抑制ｊＡＶＲ３ａ／Ｒ３ａ组合所诱导的ＰＣＤ。预测含有典型的核

7、定位信号（ＮＬ巧的ＲＸＬＲ效应分子Ｐ巧的１４２能够抑制本氏烟产生的ＰＣＤ。为明确该效应分子的功能区域，对其进行了缺失和替换突变分化构建了４个突变体。结果显示其ＮＬＳ的缺失导致其抑制ＰＣＤ毒为功能的丧失，表明该效应分子可能是在寄主细胞核内发挥作用一。为进步明晰辣椒疫霉效应分子是否具有毒性功能，本研究利用辣椒疫霉菌株接种已经表达效应分子的本氏烟叶片，测量在其表达的。ＲＮ效５撕８４４情况下，病原菌的侵染是否更加剧烈结果表明，两个Ｃ应分子Ｐ巧和Ｐ巧的化）在本氏烟上的表达能够显著促进辣椒疫霉侵染本氏烟。为明确效应分子在进化过程中面临的

8、寄主选择压力，分析了来自全国不同地区的３６个辣椒疫霉菌株中ＲＸＬＲ和ＰｃＦ／