恶疫霉pcfscr效应分子编码基因的转录特征、克隆和功能分析

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1、分类号学号—Ｕ０ｃ密级．＾＾４叫大聲１ＹＡＮＣｉＺＨＯＵＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ１硕壬学佐文（专业型）恶疫霉ＰｃＦＡＳＣＲ效应分子编码基因的转录特征、克隆和功能分析李齐原指导教师姓名：徐敬友教授，扬州大学，扬州２２５００９陈孝仁副教授，扬州大学，扬州２２５００９申请学位级别：植物保护：硕去学科专业名称论文提交日期：２０１５年４月论文答辩日期：２０１５年５月２０１５：学位授予单位：扬州大学学位授予日期年６月答辩委员会主席：童蕴慧教授２０１５年５月目录摘要ＩＡｂｓｔｒａｃｔＩｌｌ

2、前Ｓ１１１恶疫霉及其研究现状１．１分类地位及分布１１．２生物学性状１１．３引起的植物病害３５１．４研究现状２互作７疫霉与植物的２．１疫霉的侵染策略７２．２植物的抗病机制８３疫霉的效应分子９３．ＲＸＬＲ效应分子１０１３．２ＣＲＮ效应分子１１３．３Ｆ／ＳＣＲ１１Ｐｃ效应分子３．４ＮＬＰ效应分子１２４１香茄叶霉菌的效应分子３５疫霉基因功能分析方法１３１４５．１农杆菌介导的基因瞬时表达５．２１４基因沉默技术６本研究的目的意义１４１７欄歸；去１试剂和仪

3、器１７１主要试剂１７１．１．１２主要仪器７１２供试菌株巧质粒７１２．１供试菌株８２．２臟ＤＮＡ１８３１７植物培养和接种４４亥酸提取和合成１９４．１基因巧ＤＮＡ的提取１９４．２总ＲＮＡ的提取１９４．３ｃＤＮＡ的合成２１４．４质粒ＤＮＡ的提取２１４．４．１ＳＤＳ碱裂解法小量制备质粒ＤＮＡ２１４．４．２试剂盒提取质粒ＤＮＡ２２５引物设计和载体构建２２６半定量ＲＴ＾ＰＣＲ分析２４２４６．１ｃＤＮＡ样品的检测与标定６ＲＴ＾ＰＣＲ２６．２分析７细菌感受

4、态细胞的制备与转化％７．１大肠杆窗感受态细胞的制备与转化％７丄１大肠杆菌ＤＨ５ａ感受态细胞的制备％７丄２重组质粒转化大肠杆菌２７７丄３菌落ＰＣＲ验证与重组质粒测序２７７．２衣杆菌感受态细胞的制备与转化２８７．２．１农杆苗ＧＶ３１０１感受态细胞的制备２８７．２．２重组巧粒的转化和阳性克隆验证２８８农杆菌介导的基因瞬时表达２８９恶巧霉的稳定转化巧９巧．１Ｇ４１８筛选巧度的确定９．２原生质体的制备和转化２９９．３绿色巧光蛋白基因Ｇ々转入巧疫霉菌株３０９．４ＰｃＦ／ＳＣＲ基因的稳定沉默３１９４３．

5、．１基因沉默转化子的筛选１９乂２基因沉默转化子的生物学性状分析３１９．４．３基因沉默转化子的致病力分析３１结果与分析３２１恶疫霉致病相关基因的转录特征３２１．１生长发育阶段和侵染阶段ｃＤＮＡ的合成及标定３２－ＰＣＲ分析１．２致病相关基因的ＲＴ３４２恶疫霉效应分子触发植物细胞死亡（ＰＣＤ）３５３恶疫霉稳定转化系统的建立巧３．１Ｇ４１８转化子筛选浓度的确定３７３．２ＧＦＰ在恶疫霉中的表达３８４ＰｃＦ／ＳＣＲ效应分子编码基因参与恶疫霉侵染寄主的过程３９４．１基因沉默转化子的筛选３９４．２基因沉默巧化子的

6、生物学性状４０４．２．１无性阶段的形态特征４０４４０．２．２菌丝生长速率４．２．３对＆〇２的耐受性４１４．３基因沉獻转化子对寄主植物的致病力下降４２４４１恶疫霉ＰｃＦ／ＳＣＲ效应分子编码基因的转录特征４４２恶疫霉ＰｃＦ／ＳＣＲ效应分子激发ＰＣＤ４４３ＰｃＦ／ＳＣＲ效应分子参与恶疫霉侵染寄主的过程４５参考：Ｓｃ献４８５８Ｓ６２ｃ谢攻读硕±期间发表论文的扬州大学学位论文原创性青明和版权使用授权书６４李齐原恶巧霉ＰｃＦ／ＳＣＲ效应分子编码基巧的转录特征、克隆和功能分析Ｉ摘要由恶疫霉（户

7、妙啤？Ａ／Ａｏｒａｃａｃｔｏｒａｗ侵染引起的植物疫病是世界性分布的±传毁灭性病）害，危害超过２００种植物，常给草璋、苹果、梨、番茄和花井等多种经济作物的生产带来严重损失。近年来，，我国Ｗ水果、蔬菜、花井等为主的设施农业得到快速发展由恶疫霉引起的植物疫病对设施农业的威胁也Ｒ趋严重。从疫霉菌与植物互作的角度出发深入了解疫霉苗致病的分子机理，可为新的杀菌剂作用靴标巧发和植物疫病控制策略设计提供重要指导。－基于前期恶疫霉转录组测序结果，本研究利用半定量ＲＴＰＣ民技术首先分析