大豆疫霉琥珀酸脱氢酶相关基因pssdha的克隆与功能分析

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2、梢物保护学院答辩委员会主席二零一五年六月独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加Ｗ标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安徽农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料一。与我同王作的同志对木研究所做的巧何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研货生签名：４續碼时间：知少年＾月／／曰关于论文使用授权的说明本人完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文的规巧，即；学校有权保留、Ｗ

3、影印缩复送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可采用印或扫描等、段、。不不同保汇论意安徽农业大可同方式在媒体上发表制手存编学位文同学Ｗ用全或部分。容传播学位论文的部内保密的学位论文在解密后应遵守此协议（）生签：：曰研究名时间年（月￣－如Ｔ趣ＺＶ喝Ｉ一如谈签＾：：年月日第导师名时间＾私、－，１ADissertationfortheDegreeofMasterCloneandFunctionalAnalysisofSuccinatedehydrogenaseGenePsSDHAinPhytophthoras

4、ojaeByYangZhijuanSupervisedbyProf.GaoZhimouAssociateProf.PanYueminAnhuiAgriculturalUniversityHefei230036，Anhui.ChinaJune,2015摘要大豆疫霉（Phytophthorasojae）近年来逐渐成为大豆的一种毁灭性病害，导致大豆的严重减产，给国内的油料作物生产带来严重的影响，影响了经济的稳定发展。随着大豆疫霉的全基因组测序完成，大豆疫霉的转化体系和RNAi干扰技术的逐渐成熟，大豆疫霉成为了研究卵菌功能基因的模式物种。琥珀酸脱氢酶(S

5、uccinatedehydrogenase,SDH)，是三羧酸循环（TCA）的关键酶，是TCA循环中唯一一个嵌入到膜上的多亚基酶，在生物体中具有重要的作用，是连接氧化磷酸化和电子传递的枢纽，为生物体的需氧和产能呼吸链提供电子。琥珀酸脱氢酶是多亚基调控的酶，其中A亚基包含：一个共价连接的FAD、琥珀酸的结合位点、辅酶Q的结合位点；B亚基包含有三个铁硫族：2Fe-2s、3Fe-4s、4Fe-4s。琥珀酸脱氢酶的活性一般可以做为三羧酸循环的运行程度指标，是TCA循环的关键酶，而TCA循环为大豆疫霉整个生长过程提供能量。本实验通过扩增大豆疫霉中琥珀酸脱氢

6、酶A亚基中氨基酸残基的保守编码基因序列，构建了PsSDHA的沉默表达载体，利用PEG介导的原生质体稳定转化实验获得了该基因的沉默突变菌株。通过qRT-PCR实验筛选出具有良好的沉默抑制效果的沉默突变菌株A1和A3。通过沉默突变菌株的表型分析得出：在10%V8固体培养基中培养，沉默突变体的生长情况明显较模式菌株6497缓慢；在10%V8液体培养基中培养，沉默突变菌株菌丝形态发生突变，模式野生菌株6497的菌丝较细长，分叉少，沉默突变菌株菌丝短粗，分叉多；在含有0.7MNaCl、0.01%SDS、3mMH2O2、200ng/mL刚果红的10%V8培养

7、基中培养，沉默突变菌株的生长均受到明显的抑制；在其对大豆寄主进行离体叶片和整株活体侵染实验中得出结论，沉默突变体的致病性明显降低。关键词：大豆疫霉；琥珀酸脱氢酶；RNAi；表型分析IABSTRACTTheplantpathogenPhytophthorasojaeisoneofthemostdestructivediseasesthatcouldcauseseverelossinsoybeanlproduction.Itisoneofthemostnotoriouspathogenswhichcausedtremendouseconomiclos

8、sinsoybeanproductionannually.WiththeimprovementofPhytophthorasojaesy