大豆疫霉根腐病抗病基因分析及分子鉴定

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华中农业大学硕士学位论文大豆疫霉根腐病抗病基因分析及分子鉴定姓名：陈晓玲申请学位级别：硕士专业：植物病理学指导教师：肖炎农;朱振东20060601摘要大豆疫霉菌（Phytophthorasojae）引起的大豆疫霉根腐病分布在世界豆生尹殺，分雷前该菌已成为影响我国黑龙江省大豆生产的主要病原菌Z-o由于大豆疫霉菌在大豆的任何生长期均可侵染，因此利用抗病品种是目前惟一有效的防治措施。大豆与大豆疫霉菌间的互作符合F1or的“基因对基因，,假说，因此可以利川基因推导方法对大豆资源进行抗疫霉根腐病基因鉴定。随着分了杯记技术的发展和广泛应川，包括抗大豆疫霉根腐病基因在内的许多植物抗病基因被分予定位和作图。利川与抗病基因紧密连锁的分了标记对抗病资源进行检测已经成为抗病基因鉴定快速而有效的方法。本研究对121份大豆詁种（系）进行抗大豆疫霉根腐病抗性基因推导，并利川SSR分子标记技术对部分大豆品种（系）进行抗大豆疫霉根腐病抗病基因的分子鉴定，旨在明确部分大豆品种（系）的抗病基因，发掘新的抗病基因，为大豆疫霉根腐病病害防治筛选有效抗病甜种，为抗病品种选育筛选有效抗源。主要研究结果如下：川下胚轴创伤接种方法鉴定了来自安徽、吉林、河北、北京等12个省市的121份大豆品种（系）对】2个具有不同毒力的大豆疫霉菌菌株的反应，在鉴定的121个大豆品种（系）中，抗PSBX|M|株的品种（系）最多，为78个，占鉴定品种总数的64.5%；抗PSXJ-2菌株的品种（系）最少，为44个，占总数的36.4%。有9音由崙（系）抗1•12个恨|株，占鉴定品种（系）总数的79.3%；有60个人且品种（系）抗6.12个菌株，占鉴定品种（系）总数的49.6%：抗12 个菌株的甜种（系）有9个，占鉴定詁种（系）总数的7,4%；抗11个菌株的甜种（系）有5个，占鉴定詁种（系）总数的4.I%；抗10个菌株的有8个品种（系），占鉴定品种（系）总数的6.6%；抗8个、9个株的各有16个品种（系），占鉴定品种（系）总数的13.2谧7个恨I株的有11个品种（系），占鉴定品种（系）总数的9.1%；抗6个|荣|株的有4个品种（系），占鉴定品种（系）总数的3.3%；抗1・5个|荣|株的大豆品种（系）有27个，占人豆品种（系）总数的22.3%。对12个菌株都不表现抗病的品种有25个，占总数的20.7%。在黄淮海地区、东北地区、长江流域三个区域屮，以黄淮海地区的抗病资源最为丰富，抗病品种占品种总数的86.9%。121个大豆（系）对12个大豆疫霉菌菌株共产生50个不同的反应型。在49个抗病反应型屮，有11个品种的反应型为RRSRSRRRRRSS，该反应型出现的频率最高，占抗病反应型总数的11・5%；反应型为RRRRRRRRRRRR出现的频率次之，审个品种（系）发生此反应型，占抗病反应型总数的9.4%；有34个反应型仅出现1次。通过与含有已知抗病基因的鉴别大豆品种（系）的反应型进行比较，发现有51个品种共产生37个新的反应型，这些反应型既不同于任何含有已知抗病基因品种（系）的反应型，也不同于两个抗病基因组合的反应型，这些甜种（系）可能含有新的抗病基因或抗病基因组合。根据基因推导分析和sSR标记satt159和saaOO9对28个品种（系）的检认为农农釆‘4号含有Rps1a,|T|早3号、长农8号、屮黄17、屮作983、合丰41号、绥农10号、绥02.45、绥02.33、绥99.3219、绥01.5251、绥98.6iSfe,7fl§864s1c+Rps3b基因组合根据基因推导分析和sSR标记satt191和sat064对科8924-35.合豆1早、1覆9劄068.5、50794.G3016，郑97196、皖豆15等8份大豆航I』棗餐乂剪驚豆13含冇基因Rps1a+Rps4的组合，品系50794含有抗病基因RPS対弭Wi1iiams与豫豆29朵交F代自交产生F2代，从屮选择一个杂合单株自交产生F3代家系进行抗病遗传分析。采用子叶和下胚轴两种接种法相结合进行抗性鉴定，检测家系203个单株进行抗性鉴定，结果表明有153个为抗病反应型，有50个单株感病，经卡平方检测抗病株和感病株比例符合3：1,表明该家系对分离物PSMC1的抗性由一个显性单基因控制。关键词：大豆疫霉菌；鉴别寄主；抗性鉴定；基因推导；SSR标记；抗病基因 AbstractPhytophthorarootrot,causcdbyPhytophthorasojac,soneofthemostimportantdiseasesofsoybean(Glycinemax(L・・)inmajorsoybcanproducingcountriesoftheworld.Deploymentofresistantcu1tivarsiSaneffectivemethodforcontrollingthedisease.P.sojae*soybeaninteractionisatypicalmodelofgenetOgenerelationship.Llle^<亠1亠resistancegenesinsoybeanCanbepostulatedbasedonthegeneforgenetheory.Manyp1antdiseaseresistancegenesincludingseveraIPhytophthorarootrotresistancegenesinsoybeanhavebeenmappedwithmolecularmarker.Usingtightlylinkedmolecu.lar,‘，markerstOdetectres1stancegermplasmorcultlvarshasbeenbecomingarapidandeffectivewayforidentificationofresistancegenes.TheobjecIivesofthisstudyweret0technique,which78(6inPSB)(,wnumberofe6.4%、•The(7・4%)3i*n%i)iorespectiv•Among4.5%)0fcu1tiVahi1etheu1tivarsor1inerewere9,5(4・1呦，hJc1e((9s-ish呦i，teIy.rSor1ineswereressresistanttostraistanttoP・sojaestrainPSXI一2Wasonly44(3(13・2呦，16(18(6・6%),16t%J12414,(13,.9,3s呦7Cjin16虹isS貝$rQTnsTwenty—seven(22.3%ocultivarsorldeterminePhyt0Phth0rar00trotresistancegen(?sinsomesoybeancu1t•1Vars0r1ines9t0d■1scoversn0Ve1res•1stancegenes,andtoScreenresistanteu1tiVars0r1•1nest0beusedd•rect1yf0rd•sc?ascc0ntr0Iandresistancebreeding.Reactionsofl21soybeaneultivarsor1inesco11ectedfrom12provincestol2strainsofPsojaewereidentifiedbyusingamodifiedhypocotylinocu1ationSi?rfdsa^natnruarec%%艮EeelicitedSOdifinHunnghuaihairegOnehun&rcdandtwenty—onferentreactionacotgnamRssgnRdnaaspRno89ouzgnohzocncgybdcas711£nacrDmocRacouhgnohz8gnongnahptosrL7•7226-89•1usdna11525-11ous91123-99typeswitI1the12strains0fP・s0jae.Among49resistantrcacti0ntyPeRS•RSRSRRRRRSSreactiontypcwiththeh•ghestfrequcncyoccurred•n11(11.5%)cu1tiVarsor1•nes•RRRRRRRRRRRRreactiontyPewiththesccondhi嚏hfrequency0ecurred■1n9(9•4%、cu1t•1Vars0r1ineByc0mpar•1s0n0fthereacti0ntyPesofd■1fferent■1a1soybeaneu1t•1Varsor1ines,37react■10ntypesweref0undtobenewtpye丿・theyio.ccurredin51cu1tivars0r11neswhichC0U1dcarrynove1phytophthomrcsistancegene（）rgenecombinati0n• shouldhaveacombinationofRps1candRps3b一8cu1tivars0r1incsthat、"ttinferedbygenepostulatingtohaveRpsdorgenecombinationweredetectedbyusingSSRmarkers1inkedtoRps4.Zhudoul3wasproposedtoearlryacombinationofRpslaandRps4.Line50794shouldhaveRps4.Ke8924—3,IIcdouI,Tie95068,G3016andZheng97196weredeterminedtocarrygenecombinationthatcontainedRps4.OneF3familyofaFzplantwit11resistancephenotypefromthecrossbetweenWi11iamsandYudou29wastestedforreactiontoP.sojae.0utof203individualsinF3family,153plantswereresistant,50weresusceptible.Theobaaoryinbtoda・lert1*na1Osoiertrtagngeoescr1sg:ae3wsaeddceenVtartte・1ssf・11o.ItWassuggestedthaKeywords：Phytophthorasojae:Resistanceldentification；SSR；Resistancegene DNAcMPDACA缩略语表deoxyfibonuclcicacidcentimorganpotat0dext,roseagarcarrot:agarsPBNICPCNB、Ben1ate、Neomyc1insu1faterowa1、Ch10ramphen•1c01PCRpo1ymerasecha•1nreaclionSSRs•1mp1esequencerePeatsISSR■1nter—simp1cscquenccrePeatsMASmarkerass■1stedse1eetionBASbu1kedsegregationanalysisQTLSquantitat■1Vctrait1ociRAPDrandomamP1•1f•1cd1cnSthpo1ymorphismAP.PCRarb•trar•1yPrimedpcRAFLPamp1if•1edffagmem1engthpo1ym0rPh1smRFLPrestrict•0nfragment1cngthpo1ym0rPhismRGAres•stancegeneana10gsSNPs•ng1enuc1e0tidepo1ym0rph•smresistancegenetoPhytophthorasoJaesequencepIP1antIntr0ductionNILsnear—is0Scn■1c1inesCNSHetcrodcraS1ycines,SCNPAGEpolyacry1amidege1(i1(Jct:roI冲phoresisrecurrentparentsDPdonorparentsBCbackcrossAPSarnmonitmapersulphate 第一章文献综述1大豆疫霉根腐病概况1.1大豆疫霉菌的分布及危害pSojae属卵菌纲霜霉目疫霉科疫霉属。山该菌引起的大豆疫霉根腐病1948年首次发现于美国印第安那州，并迅速成为美国大豆的重要病害，该病一般可造成5%.10%的损失，仅次于大豆胞囊线虫的危害（Schmirthenner等，1985：羹由外J矢豆陵霉根腐病己分布在世界大部分大豆生产区，如欧洲的法国、匈牙利、意大利、俄罗斯、乌克兰、瑞典，大洋州的澳大利亚、新西兰，亚洲的H本和韩国，并在加拿大、阿根廷、意大利等大豆主产国危害较重（Wrathe等，1994）。在我国，沈崇尧和苏彦纯（1990）于1989年首次在我国东北地区分离到大豆疫霉菌Z后的10多年内，该菌相继在河南、山东、安徽、江苏、浙江，福建、黑龙江、吉林、内蒙古、湖北、新疆等省被发现并分离（朱振东等，2003）o目Ij｛『大豆疫霉菌已成为晞我国东北大豆主产区、新疆及部分黄淮海地区大豆生产的主要病原菌之一。表1.11996.2004年美国重耍大豆病害造成的产量损失统计（单位：千蒲式耳，¥5.00/蒲式耳）Tablei.lYieldlossofsoybeancausedbymajordiseasesinAmerica,duringfroml996to200病害Diseas炭疯细菌褐斑病褐茎腐病霜孫病疫霉根腐丝核菌根结线虫苗期病害曲核病孑包囊线虫el996199719498199920002001200220032004387890046942304014977857632510972160837729109944803783786723587513246456261382949709026612438285125163307782400614655103351019412439740411536156603412628841226971107931353540486536264222726141395455473545953555435711617381311409762017011809601170112059174936470544673662556949915346548431345245082855012317219463331121840283074408222572351891870426999655248329182081600082138622189822790561692671419671546301428821144501367222392214492098944372771576230071709222431.2大豆疫霉菌的形态学及生物学特性大豆疫霉菌在马铃薯琼脂培养基（PDA）上生长缓慢，菌落形态均匀，菌丝尤其气生菌丝致密，呈棉絮状，菌落的边缘不整齐；在胡萝h琼脂培养基（CA）上菌落生长较快，气生菌丝少，菌落边缘清晰。菌丝柔韧，无隔，直角分枝，分枝处稍缢缩，平均宽3・5pro（文景之等，1998 ）。最适生长温度为24—28”C。砲子囊乳突不明显，为长卵形，平均51.3p・m,宽24.31ma,长宽比为2:1,在自来水中2即刑!g产砲。有性生殖为同宗配合，藏卵器直径平均为35.4岬，卵抱子瘫臧天细侧生，个别围生，长X宽为121m1x11・7叫1（沈崇尧等，1990）O1・3大豆疫霉根腐病的症状该病在大豆生长的任何时期均可发生，在水淹条件下可引起种子腐烂，出苗后猝倒。在植株上的症状表现取决于品种的抗性。感病品种苗期被侵染，茎产生水渍状病斑，叶片变黄、萎蔦以至死广；耐病品种苗期被侵染，只侵染根部，表现矮化。在较老的植株上，感病甜种下部叶片黄化，上部叶片褪绿，植株萎蔦，叶片不脱落:在较耐病甜种上根腐只限于侧根，植株一般不死亡，可出现矮化和叶片轻微褪绿，症状类似轻度缺氮，偶有狭长的褪色病斑扩展到茎部一侧。1・4大豆疫霉菌的致病规律大豆疫霉菌寄生性强，只要土壤水分含量合适，在大豆的整个生育期均可造成危害（李宝英，1999）。卵抱子在植株病残体和土壤屮能存活多年，但菌丝、游动孑何子囊和游动抱予在低温下（3C以下）不能存活，适宜的温湿度可以打破卵鞄子的休眠，形成抱子囊，遇水释放游动抱子，在被侵染的根部也可形成抱子囊，成为FT1闻再侵染的来源，游动砲子通过土壤中的水进行扩散（Sebanithennef等，19关豈衣霉劇动砲子的产生、扩散及其对大豆根系的侵染是必须的，若土壤不受水淹和根系表面没有水膜，大豆疫霉菌的发病率将显著降低。因此，影响土壤湿度的因子如土壤类型，田间排水条件，土壤疏密度对病害的发生至关重要.温度诱导感病性可能是特定组合中寄主和病原菌之间识别机制的激活/抑制受到温度调控（Bhattacharvya等，1987；Gijzen等，1996）。另外，土壤中感彳輪緻魏9癫静谿•细菌可减轻病害的严重度，土壤屮的Fusariumspp,Pythiumspp或Rhizoctoniasolani均可加重疫霉病的发生，此外北方根结线虫（Meioidogynehap1a）也口J加重为害（Sinc1air够iqq91/5大豆菽霉菌的遗传变异由于大豆疫霉菌自身具有高度的变异性、种植抗病甜种所造成的选择压力以及病原菌不同生理小种问的朵交，致使不断有新的小种产生。1998年美国报导了39个生理小种，H本鉴定出10个小种群。2000年，国际上报导已有63个生理小种（Morgan,1965；Leitz和Hartman,2000）o在我国，关于大豆擬鯛鉀节热工作，朱振东和王晓鸣（1998）首先鉴定了我国黑龙江省大豆病疫霉菌1号生理小种，2000年又发现了两个新的生理小种并命名为CNR-6.CNR-7,2002年朱振东等将83个大豆疫霉菌分离物进行毒力测定，共产生72种不同的毒力型。2003年王化波等对72 个屮国大豆疫霉菌分离物进行毒力测定，与国外报道的大豆抗疫蛊根腐病抗痫基因分析及分了•咎定56个生理小种相比，除分离物PS96・41・1为已知的1号生理小种外，其余测定的均与已知生理小种的毒力基因构成不同，美国的11个生理小种屮有8个发生了变化，变异主要在3c毒力基因位点。经过RAPD聚类分组结果表明，72个大豆疫霉菌分离物屮，未出现在遗传背景上完全相同的分离物。由此可见屮国大豆疫霉菌分离物在DNA水平上发生了较明显的遗传变异，具有丰富的遗传多样性。1.6大豆对疫霉根腐病的抗性遗传大豆对疫霉菌的抗性表现类型包括两种：一种是抗病性，受显性单基因控制，是质量性状遗传，性状表现为不连续而易于进行分组，大都不易受环境条件影响。另一种是耐病性，受微效多基因控制，为数量性状遗传，非小种专化性，对pSojae的抗性持久性好，植株感病但不表现严重死亡、矮化等症状，产量基本无损失。0前人豆抗疫霉根腐病基因已被确定有16个，分别是Rpsla、Rpslb、Rpslc、民pPs勺丨，ps2,Rps3a,Rps3b,Rps3c,Rps4,Rps5,Rps6,Rps7•Rps8,RpsWD15,RpsYB30等。Loviolette等（1979）在Harosoy63中发现了显拿环堆華审艮）P左&a¥出洛、637及Mue11er等（1978）在D60.9SueTWr#S（1&ack和P154615-1中发现Rps1c抗性基因:IinM年抗性基因，鼬1吼等（1974）在CNS品种中发现了R囱产材幫唯琴10「等（1978）在戸11714Athow42和P186972—1中密轨屛f孑韋更範蕃剰种ra§中Rps3与Rps1b位于同一连锁群上，1980年年酸卅r'p°s'4°和Rps1c抗性基因；Buzze1等（1981）在Harosoy肉;1絶护椰V%P（§玄如摆龜A1tona品种鉴定Rps6抗性某因if7°大豆抗疫霉根腐病资源筛选由于病原菌的高度变异性极易导致抗病品种抗性丧失，因此必须不断筛选新的抗病资源。Moot等（1982）利川14个大豆疫霉菌小种对121份大豆种质进行抗性评价，共获得了37份抗1至多个生理小种的大豆抗性资源。Kyle等（1998）利川10个生理小种，对来口于屮国安徽，广东、河北、江苏、上海、四川、浙江等几个省份的726份大豆品种（系）进行了抗性资源筛选，共获得147种不同的反应型。“九五”期间，王晓鸣等鉴定了1600多份大豆种质对犬豆疫霉菌1号生理小种的抗性，获得了646份抗病资源。1999年许修宏等利用菌株H4对432份人豆材料进行抗源筛选，结果表明98份材料表现为抗病，占22.7%,289份材料表现为感病占66.9孙‘5份材料为中间类型，占10・4%。2003年朱振东等利用5个菌株对黑龙江省主要栽培大豆品种（系）进行了多抗性评价，结果表明冇7个品种可能含冇Rps1a或Rps1c基因，品种农大3861可能含有Rps3c基因，10个品种可能含有Rps7基因，其他率反应型的甜种可能含有未知抗病基因。2005年朱振东等川10个具有不同毒力的大豆疫霉菌接种120 个栽培大豆品种（系）进行抗病资源的筛选，发现有4个品种（系）的反应型分别与单个抗病基因的反应型一致，有7个品种（系）的反应型与2个已知抗病基因组合的反应型相同，其他詁种（系）反应型为新的类型，一些大豆品种（系）屮可能存在有效的抗大豆疫霉根腐病新基因。随着分了生物学技术的迅速发展，分子标记技术为抗源筛选提供了一种新的手段。1998年，Hegstad等利川已报道的与大豆疫霉根腐病抗病基因的连锁标记分析了18个大豆品种，结果表明1个品种含有RPs1,5个含有Rps2,7个含有Rps3,4个含有Rps4,8个含触盘因。应川分子标记技术筛选抗源，一方面为抗病育种提供了直接或问接的目的基因抗性资源，另一方面大大缩短了育种年限。1.8大豆疫霉根腐病的防治方法1・8.1栽培防治土壤湿度是影响大豆疫霉根腐病发生的关键因素（Kitt1等，1979）,连雨天或水不营及干旱胁迫均可增加病害的严重度。雨后及时排水可以减轻病害发生（李长松，1992）。实践证明与非寄主植物轮作也可减轻为害（薛津，1996）oo1.8.2化学防治朱振东等（1999）在离体条件下测定了8种内吸性杀菌剂对大豆疫霉菌菌丝生长的抑制作用。结果表明甲霜灵的EC50值为0.4870pg/mL,抑菌效果最好，安克曙、甲霜灵猛锌效果次Z。另有报道，川甲霜灵土壤处理（113.49/ha）及种子处理（0.389/kg）可有效地防治抗病大豆疫霉根腐病（At・how等，1982）o1・8.3生物防治Osburn等（1995）应用Ba11i1luscereus菌株UW85迸行防取得软体动物及鳖売上提取的活性物质聚氨基葡萄糖（Cn）,对人豆疫霉菌具有抑菌作用，同时可诱导植物体产生抗病性，提高植株自身的抗病力，1995年李宝英等（1997）用聚氨基葡萄糖制剂C95进行防治人豆疫霉根腐病盆栽试验，结果表明，0・02%C95的拌种防效最好，可达到62.3%。SM菌株对犬豆疫露具有较强的抗生作用，韩晓增等（1998）利用该菌株进行种子和土壤处理的盆栽试验结果表明，土壤处理对大豆疫霉根腐病防效为71.4%,种子处理的防效达58%,与化学防治的效果相当。1.8.4利用抗病品种由于人豆疫霉菌在人豆的任何生长期均可侵染，因此尽管该病菌存在人量生理小种且不断发生变异，但利用抗病品种仍是最有效的防治措施。抗病品种可完全控制病害，并且抗性基因易于转育，但单基因抗性强，对病菌选择压力人，容易促进 新小种的出现，从而使品种丧失抗性，利用具有多个抗性单基因的品种延长抗性的保持年限是有效的途径之一。另一个途径就是将抗病基因转入耐病品种中去（Ath。w等，1979；张国栋，1998）。1.8.5综合防治任何单一防治措施都不能完全控制人豆疫霉根腐病。利用耐病品种结合化学防治（如：甲霜灵土壤处理）、耕作栽培（如：及时浇灌、排水、轮作等）等措施可减轻病害、提高产量（Schmitthenner等，1985）；牛物防治和抗病、耐病品种蛊養嘉書（0sbum等,1995）。2大豆杂交育种杂交育种目的在于结合两个或两个以上品种（系）或种的优良性在一个品种内。有性朵交育种是根据服务地区的自然条件和大豆生产发展的要求和提高既有品种的某些特点所制定的育种目标，选择两个或两个以上具有优良性状并能够互补的詁种（系）为亲本进行人工有性朵交，通过培育选择而育成具有新的优良性状的甜种。2・1亲本的选配根据川佩占的研究认为，两亲本生育期差异越小，平均产量、含油量、含蛋白质量越高的组合，选择效果较好；亲本Z—为野生大豆时，另一亲本要选择进化程度高的品种。亲本的优点较多，则其后代的性状表现总趋势将会越好。亲本的优缺点要做到互补，即亲本的若干优良性状加起来能达到育种目标要求，一个亲本的优点在很人程度上克服对方的缺点，亲本双方可以有共同的优点但不要有共同的缺点。亲本最好两个都是高产品种，或者一个是高产品种。亲本中要有一个在育种目标所要求的重要性状上表现突出，而没有突岀的不良性状。选择地理上距离较远或生态类型差异较大的甜种做杂交亲本，能扩大后代的变异幅度，有利于选择。利川高世代主要农艺性状稳定而通过产量鉴定试验后的优良詁系作为杂交亲本，杂交后容易获得综合性状优良的个体。亲本Z—为优良詁系，另一个为优良詁种的组配朵交组合成功的比率也很高。2・2杂交方式1.2.1单交选择两个具有不同遗传性的亲本进行一次杂交，是配制杂交组合较简单的一种杂交方式，一般用显性的做父本，以便在杂种中第一代鉴别真伪杂种。单交是人豆育种中常用的方式。单交组合的第一代植株一般整齐一致，要到第二代开始性状分离，所以杂交只要做少量的花，一般每个组合做50.100 朵花。2・2.2复合杂交利用3个以上的亲本品种配制杂交组合，一般进行朵交2或3次。具体做法是先选优良亲本配成单交组合，再将这些组合间相互朵交或与其它亲本再配。1.2.3回交两个品种杂交后用亲本之一与杂交第一代回交，再以该亲本与回交后代中所选单株回交，连续进行儿次。然后将所选单株经数代自交选育出新品种。温室培育杂种后代可缩短育种年限3年。1.3后代处理方法2・3.1系谱处理法处理后代程序F2世代：自F2材料选拔单株（每组合单株不低于150株）。F3世代：将选拔的单株分别种为株系，口入选株系屮选拔优良的单株。F4世代：将来口同一F3系的单株种子，分别相邻种植F5世代：将来口同一家系的单株依次分别各种一行，先选家系，自入选家系屮选优良株系，再自入选株系中选拔F5单株。”F6世代；将入选的B单株分别种植为株系。先选家系再选优良株系。将入选的优良株系混合收获。F7世代：对入选的F5植株衍生的株系进行鉴定试验。2・3.2其他方法除系谱处理法外，还有混合个体选择法、一粒传选择法、摘荚法、早期世代测定法、轮回选择法等方法。以上几种方法处理朵交后代，在育种效果上无明显差异，而在工作量上一粒传选择法最省时省料。一粒传选择法不足Z处在于某一优良遗传基因表型单株仅有一个，容易被锄掉。最好采用摘荚法，即每组合每止常健壮株上，从屮上部摘选1・2个优良荚（3.5粒）混合脱粒•但在进行抗病虫育种以及准备研究遗传规律时，最好采川系谱法，以便追溯后代的遗传规律及利于分离选拔具有抗性基因的材料。3分子标记的发展与应用近年来，随着分子生物学的迅速发展，分子标记已被广泛应川于作物抗性基因定位。理想的DNA标记应该具有以下特点；遗传多态性高、共显性遗传、信息完整、在基因组屮大量存在且分布均匀、选择屮性、稳定性、信息量大、检测手段简 单快捷，易于实现自动化，开发和使川成本低。3・1主耍的DNA标记RFLP标记：是指用限制性内切酶酶切不同个体基因组DNA,用标记过的探针与产生的多态性酶切片段进行杂交，利用放射自显影等方法显示与探针互补的DNA片段。RFLP标记无表型效应，其检测不受外界条件、性别及发育阶段的影响，因此首先被发展和应用于人类基因组图谱（Botstein等，1980）。另外RFLP等位等位基因间不存在上位效应，互不干扰起源于基因组DNA的自然变异，这些变异在数量上儿乎不受限制，可以选取足够数量能代表整个基因组的RFLP标记，所以RFLP也被大量用于植物基因组作图。RFLP不足之处在于所需DNA的量大，耗时耗财，试验流程长。RAPD标记：指以一系列随机排列碱基顺序的寡聚核甘酸单链为引物，对所研究对象的基因组DNA进行PCR扩增，当某一引物同模板DNA有互补的结合位点，同时，这些结合位点在基因组某些区域内的分布符合PCR扩增条件，即引物在模板的两条链上有互补位置，且引物的两端相距在一定长度范围内（200.4000bp）时，就可以扩增出PCR片断。如果基因组DNA在这些区域发生变异就会使引物一模板DNA的结合位点发生改变。通过PCR扩增片断的检测，即可检测出基因组DNA在这些区域的多态性。AFLP标记：是荷兰科学家Zabeau等在1995年发展起来的，是结合了RFLPPC#的一项新的DNA指纹技术。AFLP的原理是：基因组先川限制性内切酶切割，然后将双链接头连接到片端的末端，接头序列和与其相连的限制性位点序列作为引物结合位点，利川特异设计的引物，在Taq酶的作川下能选择性地扩增限制性酶切片段。对复朵基因组AFLP常采川“两步法J预扩增和选择性扩增。“两步法”优点：一是预扩增可以为选择性扩增提供大量的模板；二是可以消除背景干扰。对大多数植物來说，较为理想的双酶组合EcoRI/MseI或Pst1/MseI与RFLP、S廂怔；可靠性好，重复性强，可信度高，对基因组多态性的检测不需要预先知道基因组的序列特征，检出的多态位点可覆盖整个基因组，克服了RAPD标记不稳定性和RFLP标记受探针来源的制约，但AFLP成本较高、技术操作繁琐。SSR（simp1esequencerepeaIs）标记：SSR拆以少数儿个核昔酸（多数为1—6个）为单位多次串联重复的DNA序列，也称为微卫星（图1・2,引自方宣钧等.2000）oSSR标记呈孟德尔遗传，与RFLP技术相比快速，并具有共显性、丰富的多态性，重复性和稳定性好及操作简单等优点。在大豆屮sSR位点可多达26个等位基因，具有丰富的多态性（Akkaya等，1992；Rongwen等，1995）。因此，S泛地应川于大豆资源的鉴定、分子图谱的绘制（Shoemaker和0Ison,1993；Larketc,1993；Shoemaker和Specht,1995）、IsSR标记技术（简单序列重复区间DNA标记技术）:即利川真核生物基因组屮广泛存在的ssR序列，设计出各种能与SSR序列结合的PCR弓［物，对两个相距较近、方向相反的sSR序列Z间的 DNA区段进行扩增，稳定性比RAPD好。RGA标记：指不同植物抗病基因具有一定的同源性，依据基因保守序列设计特异引物来扩增植物基因组DNA获得抗病基因类似物（RGA）片段。RGA标记具有广泛的应川丨j｛『景。可川于构建遗传图谱、抗病基因定位。SNP（单核昔酸多态性标记）:即通过设计的特异PCR引物扩增某个特定区域的DNA片段，通过测序和遗传特征的比较，来鉴定该DNA片段是否可以作为SNP标记。大规模的SNP鉴定则要借助于DNA芯片技术.这项技术实现了DNA分析的高能量、微型化和自动化。1.2大豆抗疫霉根腐病基因的分子标记由于多数大豆疫霉根腐病抗病基因标记与目标基因连锁距离较远，从而影响了该基因的辅助选择以及图位克隆，所以分子标记的应川取决于新的紧密连锁标记的发掘。近等基因系分析法和分离群体分组分析法是进行快速基因定位的有效方法。运川分离群体分组分析法进行基因定位时，除要考虑分离群体屮个体的表现型与其基因型的关系外，还需要注意多态性标记与目标基因问的距离不可太远以及构成近等基因池的株数要适中。利用已有连锁群筛选法和BSA法相结合鉴定抗病基因的连锁标记，通过此连锁（标记的鉴定从而将人豆抗疫霉根腐病基因RPs定位在人豆基因组分子图谱的某一连锁群上（Miehelmore等，1991）。选择此标记所在已知连锁群上其他标记或重引物，对同一个遗传群体进行遗传分析，用MAPMARKER3.0作图软件计算抗病基因和各个标记的距离，从而完成抗病基因及其标记的定位和作图。目前，利川大豆SSR标记技术已经分别在大豆基因组上9个连锁群的15个位点定位了15个抗人豆疫霉根腐病抗病基因。在人豆抗疫霉根腐病基因的分子标记筛选过程中，主要应用SSR和RFLP分子标记技术，到目前为止，已有一千多个SSR标记整合到大豆遗传连锁图谱上（Cregaa等，1999『；Wang等，2004）o10个已知大有些标记与抗病基因紧密连锁，甚至遗传距离为0,有的标记与抗病基因的遗传距离很大（表1•2）。通常分子标记与目标基因连锁距离超过IcM,则需要构建精细的遗传图谱（Guopta等，1999）。表1•2已知抗病基因材料Tablei.2TheknownPhytophthoraresistancegeneinsoybean 4抗病基因分子鉴定方法抗病基因分子标记鉴定法包括近等基因系法、分离群体分组分析法、已有连锁群筛选法及比较基因组共享分子标记法，本节重点介绍自口三种方法。4.1近等基因系法近等基因系(Near—isogenicLines,NILs)是通过杂交及多代回除了Wiffi基悅木L控制其它性状的位点同轮回亲本(RP)基本一致。一般凡是能在NILs问揭示多态性的分子标记就极有可能位于目的基因的侧翼附近，因此NILs是川于标记筛选的理想材料。在育种屮，当某一品种综合农艺性状优良但却高度感病时，常川回交的方法抗病基因转移到优良品种屮去•川于多次回交的亲本是抗病性状的接受者称为轮回亲本或受体亲本；只在第一次杂交时应用的亲本是抗病性状的提供者称为非轮回亲本或供体亲本。回交的结果，将不断提高回交后代中轮回亲本优良性状的基因血统，不断减少供体亲本的基因血统，使其后代向轮回亲本方向纯合。其回交过程一直持续到新培育的目标甜系在理论上除了含有抗病基因的染色体区段外，与轮回亲本几乎等基因时为止（方宣钧等，2000）1.2分离群体分组分析法（BSA）1991年Miehe1more等人提出了利用分离群体分组分析法（Bu1kedAnlVsr）鉴定抗病新基因的连锁标记。该方法将F2或BCFI（自交峪端袜屮研究的目的性状，根据其表型（感病和抗病）分为两组，分别提取两组单株的DNA,建立抗、感池并进行多态性引物的筛选，在两池间出现多态性的引物可能就是与目标基因连锁的标记，然后川筛选出的几个引物对分离群体单株进行验证，从而找出更紧密连锁的分子标记。由于分组时仅对目标性状进行选择，因此两个DNA混合池Z间理论上主要在目标基因区段存有差异，这两个DNA池Z间除了在抗病基因座所在的染色体区域的DNA组成上存在差异Z外，来自基因组其它部分的DNA组成是完全相同的。换句话说，两DNA池间差异相当于两近等基因系基因组Z间的差异，这非常类似于NILs,故也称作近等基因池法（方宣钧等，200°）。利3川BSA法不需创造近等基因系，利用F2或BCFI（自交F1代）的分离群体即可完成标记，简单易行，目前在辅助选择抗病育种研究屮占据了重要位置，其前景也非常广阔。4.3利用连锁群已有的标记筛选法随着SSR、RFLP等分子标记技术的发展，许多作物都已建立了高密度的分子一遗传图谱和物理图谱，为筛选与抗病基因连锁的分子标记提供简单快捷的途径。通过已有的分子遗传图谱或物理图谱很容易找到与目标基因连锁的分子标记。目前已冇一千多个SSR标记整合到大豆遗传连锁图谱上（ Cretan等，1999；Wang等,2004）o5分子标记辅助选择（MAS）借助分子标记达到对目标性状基因型选择的方法称为（mo1ecu1arasseNHfn,MAS）分子标记辅助选择。选择是育种中最重要环节之一，传统育种產违过表现型间接对基因型进行选择，周期长、效率低。此外在抗病育种工作中，某些病害为检疫对象，很难创造发病条件，多种病害接种时可能产生拮抗作川，这便给通过表型进行选择造成了困难。利川分子标记可以直接依据个体基因型进行选择，随着大量抗病基因分子标记的不断发掘及精确定位，分子标记辅助选择必将在大豆疫霉根腐病抗病育种屮发挥重要的作川（刘志文等，2005）o5.1MAS的应用1.1.1基因聚合(genepyramiding)塞囱聚合(genepyramiding)就是将分散在不同品种中的优良性状基因通回交过憂咨杂交等手段聚合到同一个品种中。大豆中所有抗疫霉根腐病基因的表型是相同的，经典遗传育种研究就无法区别不同基因，因而就无法鉴定抗病性的产生是由于一个基因还是多个基因的共同作川。采川分子标记的方法，先在不同亲本屮将基因定位，然后通过杂交或回交将不同的基因转移到一个詁种屮。通过检测与不同基因连锁的标记判断一个个体是否含有某一基因，以辅助选择，即将表型的检测转换成基因型的检测。5.1.2基因转移(genetransfer)基因(即目标基因)转移或渗入到受体亲本遗传背景屮，从而达到改良受体亲本个别性状的目的。育种过程中将分子标记技术与回交育种相结合，可以快速地将与分子标记连锁的基因转移到另一个詁种屮。利川与抗病基因紧密连锁的分子标记进行辅助选择，可以快速、准确筛选抗源、进行抗病基因分子标记鉴定及检验杂交是否成功，从而大大提高育种选择效率，缩短育种周期。5・1・3数量性状的MAS作物大多数重要农艺性状是数量性状，表现型与基因型Z间往往缺乏明显对应关系，表达不仅受生物体内部遗传背景较大影响，还受外界环境条件和发育阶段影响。对这些性状运川MAS,育种者可以在不同发育阶段、不同坏境直接根据个体基因型进行选择，既可以选择到单个主效QTL(quamitativetrait1oc看肴性点，从而避开环境因素和基因问互作带来的影响。4.2分子标记辅助选择(MAS)的影响因素mas效率随性状遗传率增加而显著降低，遗传率较高的性状，根据表型就可 较有把握地对其实施选择，此时分了标记提供信息量较少；选择效率随着群体增加而加大，一般情况下，mas群体犬小不应小于200个(Hospita1等，199影甲§6$尸;u理论上标记数越多，从中筛选出对目标性状有显著效应的标记机会就越大，事实上在选择时所用标记数并非越多越好，MAS效率随标记数增加先增后减；模拟研究发现随着QTL增加，MAS效率降低。6立论依据及研究意义由Psojae引起的大豆疫霉根腐病是影响大豆生产的毁灭性病害之一。目前该菌已成为影响我国东北大豆主要产区黑龙江省大豆生产的主要病原菌。由于该菌为土传真菌，在大豆的整个生育期均可造成危害，因此唯一有效的防治方法是利用抗病甜种。然而，大豆疫霉菌高度的变异性及由于种植抗病甜种所造成的选择压力，致使病原菌发生变异，新的小种不断产生，从而导致抗病品种抗性丧失，为此筛选新的抗病资源势在必行。由于简单重复序列（SSR）在大豆屮具有高水平的多态性（Akkay等，1992）,SSR作为一个新的标记止广泛地应用于大豆资源的鉴定、分子图谱的绘制及目标性状基因的标记（刘峰，2000）。以PCR技术为基础的SSR标记技术与RFLP技术相比具有简单、快速等优点.另外，在大豆屮RFLP位点的等位基因很少多于两个，而SSR位点可多达26个等位基因（Wang等1995）,因此极大地提高了在任何一个给定群体屮一个位点就能提供信息的可能性。在大豆基因组整合遗传连锁图谱上都可以找到与抗病基因相邻的SSR标记。这些标记为抗大豆疫霉根腐病基因的鉴定、抗病育种的标记辅助选择和抗病基因的克隆奠矩了基础。本试验通过对我国大豆疫霉病发生区主要栽培大豆甜种和地方品种屮抗大豆疫霉根腐病基因的鉴定，明确一些抗源的抗病基因型，筛选出综合性状优良的抗源，发掘新的抗性基因，为有效地开展抗大豆疫霉病常规育种、抗病基因累加和快速的分子辅助育种奠定基础。 大豆抗疫蛊根腐病抗辆草闪分析及分了•咎定第二章大豆疫霉根腐病抗病基因分析由于大豆疫霉菌的高度变异性极易导致抗病甜种的抗性丧失，因此必须不断筛选新的抗病资源。大豆和大豆疫霉菌之间的相互作川符合基因对基因假说（geneforgenehypothesis）,即对应于寄主的毎一个决定抗病性的基因，病原菌方面也存在一个决定致病性的基因；寄主.寄生物系统中，任何一方的每一个基因都只有在另一方相对应的基因存在和作川下才能被鉴定出来。本研究采川基因推导方法对121份大豆甜种抗大豆疫霉根腐病基因进行分析，旨在明确一些大豆品种的抗病基因类型和发现新的抗病基因，为大豆抗疫霉根腐病抗病育种奠定基础。1材料与方法1・1试验材料1.1.1大豆品种（系）121份大豆品种（系）由屮国农业科学院作物科学研究所提供，包括山东、山西、黑龙江、吉林、辽宁、安徽、北京、河北、河南、浙江、江苏及湖北等12个省市的品种（系）（表2.1）。14个含单一抗大豆疫霉根腐病基因（PSojaeresi克6?屮佝鑒痢鼎种f系）原种和不含任何RPs基因的大豆品种Wi11iams由美国0皿寻矢学Schmitthenner博士提供，在中国农业科学院作物科学研究所保存和繁毎别寄主名称及携带抗病基因为IIar1on（Rpsla）、Harosoyl3XX（Rpslb）、W79PL6oC23S1S一msP6apR41R(11(8X198r9ss5psORD3(R一X(5X3827)、PI103091(Rpsld).Wil)、Chapman(Rps3a)、6(Rps3b)>PRX145-48(Rp(Rps5)、Harosoy6)、IIarosoyfRps7)和P1391iams82(Rpslk)、L76—1s3c)、L85—2352(Rps4)、2大豆疫霉菌PSAM1、PSBX、PSFJ、PSJN4、PSXJ、PS41-1、PSMCI、PSNK55、PSHY331PSZLT、PSJMS—2和PSXJ・2等12个人豆疫霉菌分离物由中国农业科学院作解畳需提供，分别来自美国、巴西以及中国的福建、新疆、黑龙江、山东、安徽和内蒙古等省（自治区）的大豆疫霉根腐病发生区。1・2试验方法1.2.1培养基制备 胡萝b汁琼脂（CA）培养基：取2009新鲜胡萝卜榨成汁，四层纱布过滤备用。800ml水屮加入159琼脂煮沸，待琼脂溶化后加入胡萝卜汁煮10min,四层纱布过滤定容至1000ml,分装高压灭菌。PBNIC选择性培养基：以CA为基本培养基，配 方为每1000mi加入50%Benlate（50%苯莱特）0・019,75%Ter秦集£b/3§i^：eo：myc那伸nsu1fate（硫酸新霉素）0・Ig,Rov049,CK1oramphenico1（氯霉索）0・19。分装高压灭菌。表2.1川于本研究的大豆品种（系）Table.2・hisstud1.2.2大豆疫霉菌单抱纯系建立采川游动孑包子分离法建立12个大豆疫霉菌的单抱系。在CA培养基上培养大豆疫霉菌5.7d,用消毒的解剖刀挖取1・5x1.5cm2的菌丝块放在直径6cm培养皿尖无榭水至菌块高度，在24°C条件下孵育18.24h,然后在显微镜低倍镜下观察，当发现有大量游动也了产生时，即刻进行游动砲子涂皿：川消毒玻璃棒将稀释的游动鞄子菌悬液均匀涂在PBNIC选择性培养基上，倒置培养于25”C培养箱屮培养至单菌落形成，挑取单菌落于CA培养基上扩繁川于毒力测定。1.2.3植株的培养每个鉴别詁种（系）分别挑选12粒左右种子播种于以灭菌蛭石为基质的塑料营养钵中.出苗前培养温度25.29”C,出茁后温度18-25°C,第一对真叶展开为最佳輸寸间。 大豆抗疫宙根腐jijj抗稿草因分析及分子鉴定1.2・4接种鉴别菌株在含1・5%琼脂的胡萝卜培养基上培养7-10d至菌丝长满培养皿，川201111注射器将其捣成匀浆。在大豆植株幼苗下胚轴近子叶处划长度为1ena左右的伤口，用2m1注射器接种10・12株（接种量一般为Iml接35—40株），24C培养證中依48h,转入温室继续培养。t・2.5发病情况调查及抗性评价标准在温室屮培养2.4d,统计发病率。抗病植株正常生长，不倒伏；感病植株伤口处腐烂、缢缩、倒伏。发病率S30%的甜种为抗病品种（R）,发病率370%的晶种为感病品种（S）。发病率介于30%——70%之间的记为中间型（I）。试验重复两次。2结果与分析2・1鉴别菌株及其毒力釆川稀释涂皿单抱分离法获得12个大豆疫霉菌分离物的单抱系，川14个含有已知抗大豆疫霉根腐病基因的大豆品种（系）对获得的单葩系进行毒力测定。根据毒力鉴定结果，每个分离物最终选择一个单葩系作为鉴别菌株（表2.2）。从表屮可以看出，12个鉴别菌株的单孑包系都具有较强的毒力，PSXJ-2毒力最强，能击败除L—ft.1.--^85.2352（Rps4）以外的13个鉴别品种所含的抗病基因，PSXJ与来自内蒙沙画ZLT的毒力相当，毒力最弱；來自安徽的两个菌株PSMC1和PSHY33・1的宙当；来自山东的PSJN4与来自福建的PSFJ及来自美国的PSAMI毒力都较强；来自黑龙江和巴西的PS41.相对较弱。PSNK55、PSJMS.2、PSBX菌株毒力表2.212个人豆疫霉鉴别菌株毒力测定Tab1c.2.2SelectcdstrainsofPhytophthorasojacforanaiysisofPhytophthoraresistanccgcncsinsoybeans人H疫霉曲（株系）米源毒力型£!型丝！！！堡竺！！型！！！！！垒21.PSXJ-2魁强&in.1b.1c.1d.1k.2.3n.3b.3c,5.6,7,8PSMCI安徽1五ld2,Ja,Jb,3c,t工五7,8PSHY33—1薯t搬1&ld2.3口.3b・k.4.s.6.7,8PSAMI美国lb.Id.Z3a,3b,3c.4.5.6.7PsFJ福建la.lb.le.ld・l7PSJN4山东lb,2.3珥3E3c,4.5・6.7,8PS41-1黑龙江la.Id,3a,8,Jc.工67,8PSNK55黑龙江lb,3・J—3b,3e,5・6・7PSJMS-2黑龙江la,1b,1c,1d,2,3b,3e,5PSBX巴西lb・1c,ld・1k.2.4.6,7PSZLT内蒙古ld・2.Jb.Je,5,7 PSXJ新強ld・Z3c,6・7 1.2大豆品种（系）抗性鉴定川下胚轴伤口接种方法鉴定了121个大豆甜种（系）对12个不同大豆疫霉菌菌株的抗性反应。图2.1显示了大豆品种（系）分别对12个菌株呈抗病反应的百分率，其屮抗PSBX菌株的品种（系）最多，为78个，占鉴定品种（系）总数的64.5%；抗PszU，菌株的甜种（系）次之，为74个，占鉴定品种（系）总数的61.2%；抗PS41.1菌株的品种（系）有70个，占鉴定品种（系）总数的57・9%；抗PSNK澡麻的品种（系）有67个，占总数的55・4%；抗PSJ'N4菌株的品种59个，占总;4・%的-s8数劭•总?8afus45»Ap%83的数o抗PsFJ菌株的品种56个，占总数的46.2%；抗PSMC1菌株的品'罩0・4s・S岫如加仲040・！39.71.3%；抗PSAm1和PSHY33・1菌株的品种有49个，占总数的2菌株的品种48个，占总数的39.7%；抗PSXJ菌株的品种为46个,抗PSXJ.2菌株的品种（系）最少，为44个，占总数的36.4人豆疫密茁尸.ivarsor1inestodifferen图2.1抗病基因占选择品种总数百分含量的比鉉Fig.2.IPcrccntagcofrcsistancccuitstrainsofP・80jae一0冀｝口1nQ一誉-•嘲缸求皿容霉瞳馔璐00暮1S晶2_ooo咖暑口。善〜菌株数Numberofstrai ns图2.2抗不同人豆疫霉菌菌株数犬豆品种（系）的数量Fig・2・2PcrccntagcofcultivarsorlincsrcsistanttodiffcrentnumbersofPhytophthorasoiaestrains121个大豆品种（系）屮，25个詁种（系）对供试菌株均表现为感病，占鉴定品种（系）总数的20.7%,其余96个品种（系）对12个人且疫霉呀11荣|株1个或多个表现抗性，占鉴定品种（系）总数的79.3%。图2.2为人豆品种（系）抗不同数量菌株的统计，其中抗6-12个菌株的大豆品种（系）有60个，占鉴定品种（系）总数的49.6%；抗12个菌株的品种（系）有9个，占鉴定甜种（系）总数的7.4%；抗11个菌株的詁种（系）有5个，占鉴定詁种（系）总数的4.1%；抗10个菌株的有8个品种（系），占鉴定品种（系）总数的6.6%；抗8个、9个菌株的各有16个甜种（系），占鉴定品种（系）总数的13.2%；抗7个菌株的有11个品种（系），占鉴定品种（系）总数的9.1%；抗6个株的有4个品种（系），占鉴定品种（系）总数的3.3%；抗1.5个菌株的大豆品种（系）有27个，占总数的22・3%。2・3抗病基因推导14个含有不同抗大豆疫霉根腐菌单基因的大豆品种（系）和Wi11iams对12个大豆疫霉菌鉴别菌株的反应型见表2.3。通过与14个鉴别詁种（系）对12个鉴别菌株反应型的比较，12个大豆疫霉菌鉴别菌株接种121份大豆詁种（系）共产生49个不同的抗病反应型（表2・4）,抗病资源丰富度为40・5%。反应型RRSRs鼬t魁yTlsS（推导抗病基因型为RPs1c+Rps8,Rps1k+Rps8,Rps1a+Rps4）伞翩甲嫌良应1型总数的11.5%；反应型RI引e2・P.RRZRRRR（推导毎増特嬖辛a+Rps2）f1j现的频率次之（9个品种），占抗病反应型总数的9.4%；京种的皮应型仅出现一次。 表2.314份鉴别寄主对12个大豆疫霉菌菌株的反应型Tab1e2.3Reactiontypesofl4differentialcultivarsorlinestol2strainsofPhytophthorasojae品种名称抗病基因反应嘤CultivarsorlianeresistancegeneReactiontypeIIar1onRps1aRRSRSSRRRRSSIIarosoy13XXRps1bSSSSRRSSSRSSWi11iams791勖slcRSSRRRRRRRSSPI10309lRpsIdSSSRSSSRSSRSWi11iams82Rps1kRSSRRRRRRRRSL76・1988Rp$2SSSSSRSRSSSSL83・570Rps3aSRSSRSSSSRRSPRX146.36尼锥拍SRRSRSSSSSSSPRX145-48足哪3cSRSSSSSSSSSSL85-2352RpZSSRSRRSRSRRRL85・3059/7oos5SRSSRSSSSSSSIIarosooy62XXRps6SSRSSSSSSRRSIIarosooyRUs7SSSSSSSSSSRSP1399073R珈8RRRSRSSRSRRRWi11iamsrpsSSSSSSSSSSSS品种长农14号的反应型RRSRSSRRRRSS,与含抗病基因Rps1a的品种H的反匾熬丄致;1酋黄462号、99鉴15、商951099,比10、99nf79、中野RR§§§应型SRSSSSSSSSSS,与含抗病基因Rps3c的品种PRX145-辱尊.11・5、科8924-3、野9和50794等4个品种（系）的反应型为SSr,与含有Rps4的品系L85-2352的反应型相同，可能含有Rps4：012具有相同的反应型SRSSRSSSSSSS,与含抗病基因Rps5的品种舸皮应型彳数.59在49个抗病反应型中，有83个品种的反应型与含已知抗病基因的14个品种的反应型不同。有32个品种（系）产生12个两个抗病基因组合的反应型：科新4号、周豆12、周9521・3—4・10、周豆13、铁95068・5、郑9525、豫豆2笔9犁鳥需七紮:H鞭血曲％PRRRRKRRRRR&,符合抗病基因组合Rps1c+Rftps'1k+Rps8、Rps1a+Rps4的反应型；科丰36、合豆1号、5076毕剧科前疲屋耋为SRRSRRSRSRRR,不符合任何单基因的反应型，但与抗病基因组合Rps3a+Rps4>Rps3b+Rps4,Rps3c+Rps4>Rps4+R晓看？辱将農应聲为賞沓RgRRRRRRRR,与抗病基因组合Rps1c+J挚够4、R皮血如土藪F爱32—425、nf152与抗病基因组合Rps1c+Rps6・Rps也k衣;R品种@g勺取审2的反应型RRRRRRRRRRSS,可能含有抗病基因Rps1c禹昴1^004的反应型SRRSRRSSSRSR,可能含有抗病基因RPs1b+R备$宾狠唧綽、中黄17、中作983、合丰41号、绥农10号、绥02—45、绥02—336、 8.622%7、绥02—259、绥99.,R苛就着理辯因Rps1a+Rps3219和绥01・5251等11个品种2的组合；中黄10和冀黄104具有相同SRSSSSSSSSRS,可能含有抗病基因Rps3c+Rps7的组合。有51个反应型，它们即不同于14个鉴别寄主的反应型，也不同于两个含有己知抗病基因詁种（系）组合的反应型，占反应型总数的74%,丰富度达72.5%。 H秘毯扑串匿睡心8II扑K割《哥冉§I镒1芝1岛I量1菇8盆十岂”爵盆十o1S盆口"盆土rr盆占"盆乞fs爵叶阳9『十兰基，甘00盆十3100盆=、置譬N”盆+8r目曰oong牙十uIs盆oo一舔畦，a&—s%o妒。一《赠N簿嚣婶曼%ofqn吁N_萇八帐熏瞳嘲KBI气一嚨8星凸型醍《般洋6曷盛诵騎滋嗚嚅一叶H=-•NN姜专8雌Z&谨冊愿敢衿她小脛巅,伸丿si国诵LfB)|i』oitK^KSdogg-匠副皇甚差陋曲配I材LE氈原醴酋秋幡炬I數辆I篮歐《5轉病一臣 一心—寸・副型博农啦T越型博g,链暂umH爵八目1i}十umoo毒4m解牙十。一拳牙n”盆十葛盆…"盆十。£oo盆，，"盆十oomoo爵，—co争1+aneo爵审H留岳，。£cAa夏x巒習bN10翩论漏N侧察妒h《域々一8口n啦獲…，吵0葛）」1一廖形审m斗俏2槛乎=*窿—M辎尿苛如b|礫苦fAUgnj；b00_n嘲加占n冲痞~onI.,q=呦长蜥熾乎閘聚呼0|。n06蓑—09樊，苫”n）（“o.g蜓ia斌誉鐵】减敬％嘯上，O0SQQ0QS躺门韌E删csSQQS遴4£曲嚇;；COOOOOOC8CC麻纠闽切8更瑕贰严88们比心激厢]S800000080^茧沸弹姐00.匣“〃IjgCO诂言曽嚴名岛醒8酗们严产“毒窃茨菇殄）0000g0C888QQ沁却g郦『ggoooossp^辎00oosscxTg^fipVog-±L,B^fi.惺，2烈66,审II导域•早做审心静卜求《嚣求区辨壤嬉馔罄1}I啦糕蜒嘲K讪,徹8S〃免S&會马篮S《篮g[藏规幽S们8考Is《匠匝8醒g8名哆牛00——《Eoog魅盈羽分二般2cog00goolMocI期雷繼c畲酉皤呼訝呢醒寥瞻怪啓别 2・4抗病资源的分布对抗1.12个菌株的各地区抗病詁种（系）统计（表2.5）表明，3个大豆种植区屮黄淮海地区抗性表现较好，抗病品种（系）占甜种（系）总数的86.9%；东北地区抗病品种（系）占品种（系）总数的68.9%；长江流域的抗病品种（系）占品种（系）总数的62.5%。表2.5抗大豆疫霉根腐病甜种（系）分布Tab1e2・5DistributionofeultivarsorlinesfromdifferentprovincesresistanttoPhytophthorasoja•:括号内数据表示抗病品种占鉴定总数的百分率（％）°；Thedatainparenthesesispercentageofresistanceculfivarsor1ines对10个以上品种（系）的省市抗6-12个菌株品种统计结果表明，来自黑龙江省的品种（系）中，抗病品种（系）占总数的85.7%；来自北京市的品种（系）中，抗病品种（系）占总数的85.0%；来自吉林省的詁种（系）屮，抗病詁种（系）占总数的80.0%；来自安徽省的品种（系）屮，抗病品种（系）占总数的75.0%；来口河南省的品种（系）屮，抗病品种（系）占总数的47.4%.黑龙江省抗病詁种所占比率最高。表2.6河南等5省抗多抗大豆品种（系）数Tab1e2・6NunberofeultivarYorIinesfrom5provincesresistanttoC—12strainsofPhytophthorasojae來源数龟盔呈丝垩鱼鱼堡鑒丝！翌！！！！！£：!型竖墨！！虫！3讨论1.1抗病基因推导在基因对基因的植物病害系统屮，应川基因推导鉴定抗病基因是一种简便、快速的方 法。该方法已被广泛地应川于抗小麦锈病、白粉病基因鉴定和抗大豆疫霉根腐病基因屮. 查垦垫壅墨塑塑堑芒堕芒塑樂堑墨樂壬鳖榛证抗病基因准确鉴定的关键之一是鉴定材料的遗传背景。只有具有清楚遗传系谱的品种和甜系的抗病基因才能较为准确地被鉴定。大豆疫霉根腐病在我国发生较晚，有目的的抗病育种才刚刚起步。0I;｛『还没有含有已知抗病基因的大豆品种（系）应用于生产。因此，当前栽培大豆詁种（系）屮同时含有两个抗人豆疫霉根腐病基因的可能性较小，除非两个基因在同一连锁群并连锁。根据基因推导的结果，32个品种（系）可能含有两个抗病基因组合，51个品种（系）基因型未明确，共83个，占试验品种（系）总数的68.5%。由于现代栽培品种（系）是人工选择而成，詁种含有两个抗病基因组合的可能性较小，所以这些甜种（系）屮大部分可能含有新抗病基因。长农8号、屮黄17、屮作983、合丰41号、绥农10号、绥02—45、绥02.336、绥98—6227・7、绥02—259、绥99.3219和绥01.号品种（系），这些品种（系）有可能来源于同一个亲本。1.2抗病资源的分彳|j对10个以上品种（系）的省市抗6.12个菌株詁种统计结果表明，来自黑龙江省的詁种（系）中，抗病品种（系）占总数的85・7%,与Lohnes（1996）、Kyle（19衆尊）（积希琛6）的研究结果有较大的差异，其可能原因在于来口黑龙江省的21份品种（系）中，有14份品种（系）是“绥字号品种，占品种总数的品种70%,与此相反，反应型却仅有7种，说明这些品种很可能具有相近的血缘关系，甚至来源相同的亲本，因此造成该省统计结果偏高，不具有代表性。根据大豆栽培区划将大豆品种（系）来源划为东北地区、黄淮海地区和长江流域3个区域，结果表明黄淮海地区的抗病品种（系）最丰富与Lohnes等（1996）、Ky1e等（1桀損亲含、（2006）鉴定结果吻合。所以，在进行新的抗病基因发掘时应该时优先考虑黄淮地区的大豆资源。同时，抗病资源的筛选应该以地方品种和野生大豆为主，以丰富栽培大豆的抗性多样性和遗传多样性。3・3抗病品种的利用在鉴定的121个人一巳品种（系）中，有24个品种抗10—12个人一巳疫霉菌廉|株，具有很宽的抗谱，其中科新4号、周豆12、周9521.3—4.10、周豆13,铁95068.5、9§H,6豫豊29和郑97196等9份品种（系）对所试12个大豆疫霉菌表现全部抗病。这些大豆品种（系）大多来源于河南省，在黄淮海地区以直接川于病害防治。在东北地区，具有广谱抗性的资源较少，可以考虑利用河南、安徽等抗性资源较为丰富地区优异抗性资源进行抗病品种的选育。 第三章大豆疫霉根腐病抗病基因RPS1位点等位基因的分子鉴定Weng等（2001）鉴定了3个与抗大豆疫霉根腐病抗病基因Rps1a连锁的SSR标邂锁脸齡幕脚呂阳找荊1.sa』q59、sat4009和sattl52。标记satt159和saal52位于基因的一9cM,标记satt009位于基因的另一侧3・2cM处。第推tSl表明，科新4号，周豆12等28份大豆甜种（系）可能含有Rps1位点的等位基因。本研究利用与Rps1a连锁紧密的分子标记saal59、satt009对可能含有Rps份人豆品种（系）进行鉴定，旨在明确这些品种中是否含已知抗病基因RPs1位点的等位基因。1材料与方法1・1试验材料1.1.1大豆品种（系）对照大豆品种有Wi11iams（rps）＞Harosoy（Rps7）＞Mukden（R含有艮PsF杓点仍§不W?I11（?im!进毎基因系L66.180（Rpsla）＞L77.20^P1,^77-5203l95°ORps1d）、L76—2060（Rps1k）oMu群铀仿减柴和母1（gps7）的轮回亲本（0X281是两建曙壊囱萦槩芟衛生品系）。待测品种（系）:根据第二章抗病基因推导结果，筛选出可能含有抗病基因RPs1位点等位基因的人豆品种（系）28份，详见表3.2。由中国农科院作物科学研究所提供、1.1.2SSR分子标记引物与Rps1a紧密连锁的分子标记satt159和sattOO9的引物序列及遗传距引物爵老桀奏首盛生物工程有限公司合成。表3.1与Rps1a连锁的SSR标记的引物序列Tab1e3・IScqucnccsofprimcrsSattl59andSaH009SSR标记引物序列（5L.3,遗譬篓离（cM）SSRmarkerSequenceofprimerpair（5;,33disL幽％oSattl59uppcrp—merLowerprimetO・7伊J®1gccca呂柏a锄cctoota8嵋柚g“瓢IH帕柚ta驴Satt009upper君观'艮Lo店erprimHJ*3.2 大豆抗疫宙根腐病抗病摹说分析及分了鉴定1.2基因组DNA的提取1・2.1大豆叶片DNA提取方法取大豆嫩叶组织加入液氮研磨成粉末状，装入2・Oml离心管,加8001.dl%SDS缓65冲溪氷浴0.5-2h（中间摇动2至3次）后取出，冷却；加入7501A1酚一氯仿（1:搖纺1年攝爪iu,8000rpm离心10rain；取上清加入氯仿一异戊醇（24；1）7f（P^O-ri3。”?祁左淸液缓慢加入预冷的异丙醇摇动几次至DNA出现，8000rpm离心2raino弃上清液，加入70%乙醇300—400p1洗2.3次，干燥过夜。加入4f_t1RNA酶去RNAo提纯DNA步骤：向干燥后的初提DNA中契400p1酚.氯仿，振荡10.15分钟后8000rpm离心10min。取上清液加氯仿.异卑翳X63:1J1振荡10min,8000rpm离心10min,取上清液缓慢加入异丙醇（预枫3扌書劫儿决塞金弋A出现8000rpm离心2rain。弃上清液加入70%乙醇洗2・3lOOplTEBuffer溶解。1.2.2大豆千种子DNA提取方法取干种子两粒，去净种皮后在研钵中研磨至粉末状，平分六份移至1・5ra1离心管中,入州拠加膏清歼500I_t165HC预热的4%SDS提取缓冲液，混匀。65°C水浴0.5.2h（颠倒1NaAc,混匀，冰浴10min,颠倒离心管直至形成乳状液。△善申耳加入两倍体积的冷乙醇，混匀，放置5-1Omin,500rprn离心5rain,取上pm离心5raino将上清移00rpm离心得到DNA沉沁?Buffcr溶解后再利川氯仿.异戊醇（24；1）和氯仿各重复提取一次，风FDNA后，每•3加存.W-保11TE缓冲液浴解沉淀，并于.20"C1.3.1PCR扩增反应体系10v1体系中含50・100n£基因组DNA,O.5nM的引物对，1UTaqDNA2・聚令购H10xBuffer（含M92+,北京天为时代科技有限公司），0.2niM的dNM•泌司订京鼎国生物科1-3.2PCR扩增反应程序PCR扩增在MJResearchthermocyc1er上进行。反应条件为95°C预变复3萎屢25s,47”C退火25s,72C延伸30s0最后68C延伸10mino1.4PCR产物的聚丙稀酰胺凝胶屯泳 川洗涤灵将玻璃板洗净、风干，川无水乙醇重复擦两次，耳板川1ml.2m12%剥离硅烷涂匀，平板川Im1—2m10.5%亲和硅烷涂匀，稍放置片刻，待硅烷全部挥发后，川胶条和夹子固定两板，水平仪调平。配制聚丙烯酰胺变性胶，50m16%变性胶中加入80mTEMED、200ra过硫酸鞍摇匀，快速灌胶,聚合约30rain左右。1・4.2配制显影液1100ml蒸憾水中加入359无水碳酸钠溶解后保存于4”0冰箱备用。1.4：3扩增产物变性扩增产物中加入6mloadingbuffer,95oC变性5mini.泳在95W功率下预电泳30min左右，排除点样孔中的凝胶残渣，上样（5—1Ota）,9功率卜讷＜1.1.5ho1・4.5脱色与固定将电泳后的凝胶放入10%固定液（1100nii蒸憾水中加入110ni1冰醋酸）中轻摇30左右严塞猖示剂无色。1・4.6银染重蒸水洗3x5min后放入染色液（1100ml蒸憾水中加入1・Ie,AgN03）轻摇约30mino1・4.7显影川重蒸水洗约5see后立即放入显影液屮快摇，至DNA条带出现。1・4・8定影10%冰乙酸中固定约5min,用重蒸水漂洗，室温干燥，统计带型，照相。2结果与分析2・1两种大豆DNA提取方法的比较两种方法各有优缺点：大豆千种了DNA提取方法快速，无需经过植株培养的步骤，大大缩短了试验时间，但该种方法要求种子的活力较高，否贝II提取的DNA浓度相对较低，质量较差，大量蛋白质不易除净；叶片DNA提取方法相对较慢，但DNA的纯度、浓度较高，蛋白质可去除完全。2・2抗病品种（系）抗病基因的SSR标记检测标记Satt159检测：在一套对照品种中引物对satt159扩增出3个多态性标记，其WiT1iams及其分别含有Rpsla、Rpslb和Rps1d的近等基因系L66.180、凝箱同？专护幽理鞭竄去;•紐BRen、L75.3901（Rps1c）和L76-2060arVs标记不同于其它对照品种。在检测的28份大豆品种中有22 个品种（系） 盔里垫壅壁堡堕堕垫堑芒塑樂堑墨樂壬鳖齧有与Mukden、L75.3901（Rps1c）和L76.2060（Rps1k）相同的杯隔因未获得扩增产物，豫豆29扩增出与其他品种（系）不同的标记（图3・1,表3・2）标记Sa9009检测：对照品种SaR009可以将Mukden和Harosoy分开，也与分剌窖卷HpsH?g^ps1c和Rps1k的近等基因系L77—2061、L75.390enOp和L76・2060（Rps1k）的标记相同。在检测的28个大豆吊聊不需种曳葉）含有与Mukden和L76—2060相同的标记（图3.1,表3.2）。3讨论由于Rps1a位点含有5个等位基因，应川基因侧翼的SSR标记检测区分不同的等位基因是十分困难的，必须结合其它方法如基因推导方法或基因内标记进行区分。基因推导结果表明，长农14号的反应型符合含有Rps1a的品种Har1on的反应型，FT1早3号、长农8号、中黄17、中作983、合丰41号、绥农10号、绥02—45、绥02.33、绥99一1、绥98.622%7符合Rps1a+Rps2基因组合的反应型，结合分子标记累都含有RPs1a的标记,因此推断这些品种含有RPs1a。品系50052基因。绥02.25s1c+Rps3b基因组合，分子标记检测含有SaR159标记，可以推断该品种含9推导含有RPs1a+Rps2基因组合，由于没有进行标记SaU1009标记，不能确定是否含冇Rps1ao在其他品种（系）均检测到标记Sat09屮的一个或两个，但基因推导结果表明一个品种（系）存在两个以上基因组合的可能性，因此不能确定含有Rps1位点的哪一个等位基因。 3Hu«g2权牲单扑+匣唾誉N亏鲁胚月《廿爵U「三冑-rZFZZZHE0一M8L*96SIES0描袅鞭:即篇=21则暑n梵S曩。暑瓮H昴A#嚣oo2^行BArfit露嚇睿的川帧呕惧辐）luiif函J02爵暑嗣嚣冒分虜 ++++H+++H〜I,X去盘X一—・止F畫―-口+++arM+TH...+++XL++++爵轡昙gSoo召嶂Esg+H++++蔓签aMo…++H++++4{s量口「+++++++H+++器车召如蠹°暑嚣aoooo灣瞬爵昏m碼黔4s曰倏VK曰°sM葺foci鳏蟠舶。聲姑匿确ook霄｝，爭童基也补礙撕乐掌溥晦曲热薯。盘瞰捞W毒狀暂kF睛置一晴。一。=露世摊Nli求越舉求区捧馔塔器篷晕付锚辖卿K隹喜肇事8蠢11"2q鲁一二匕『趨毒十抑4D册嬲適n橋感看曹16毒星隔#土绞隧爵召n斗崔菩oh翔血芒笛n•—矗,r怜『轄《一帆麻I爲谄嘟獨制攵壬hnN1百需--咖80川Qn戒鲫准-g崭口"爨小瓣0嗣喜刿亠1。护i廿盆…"N.n.0_量矗一描=N00污惮阳•寸憎oH鬲口。口墨SI壁宴q90等一*n々,10雄确茜00缁2矗t心一高芒二二懈祸《嶠赅，H〜矿JZ 第四章大豆疫霉根腐病抗病基因RPS4的分子鉴定基因推导结果表明，有8份大豆品种（系）可能含有抗病基因RPs4oDevinde等（2「004）鉴定了2个与Rps4连锁的SSR标记saal91和satt_064。标sI分别为10・5eMo而标记sat_064与基因的连锁距离为0eM,研究利用这两个标记对可能含有RPs4的8份人豆品种（系）和2份不含Rps4的品种进行鉴定，旨在明确待测品种中是否含已知抗病基因Rps4o1材料与方法1・1・1大豆品种（系）本试验共选用了12份大豆品种，由屮国农科院品种资源研究所提供（表4.1）。对照大豆品种（系）:Wlliams>WUiamsL85—2352（Rp待射犬豆品种（系）：科8924—3、合豆1号、50794、皖豆15、周豆13、铁G3§196等8份可能含冇抗病基因Rps4大豆品种（系）和2份不含Rp餡為种濮6018、郑90007大豆品种（系）。1.1.2SSR分子标记引物sSR标记saa19Unsatt064的引物序列及遗传距离详见表4・1。引物由百盛垩覇奉程有限公司合成。表4.1引物satt191和sat—0Tab1c4.1S°c幺區列ccsofSSRprimcrpairssatt191andsat064 大豆抗疫蛊根腐痫抗病募斟分析及分了鉴定1・2基因组DNA的提取人豆叶片DNA提取法，具体步骤参考第三章1・2・1。1.3SSR扩增反应体系和反应程序见第三章1.3。1.4抗病品种(系)中抗病基因Rps4的检测。琼脂糖凝胶电泳2%琼脂糖凝胶进行电泳(恒压U=150)检测PCR扩增产物的浓度及质量；鉴定筛选出的可能含有Rps4的8份大豆甜种和不含Rps4的2份品种。具体过程如下：(1)分别称取20m110xTBE和29琼脂糖粉加入180ml去离子水,加热至沸腾月鮪巔胶粉溶化。(2)冷却，待凝胶温度降至504C左右时，加入10mg/m1的EB母液10p1(终..,为W_tg/nd),摇匀，将胶倒入胶模中。(3)将梳子插入胶中待凝胶凝固后拔掉梳子将胶模放入电泳槽中，倒入1xTBE至刚好淹没点样孔。(4)在20mPCR产物中混入5m5x点样液(50%(v/v)甘汕，50mmol/LEDTA,pH8.0,0.125%(w/v)溟酚兰，0._C5)囉蠢子，丿(6)结束电泳后取出凝胶，在紫外灯下观察并照相。2结果与分析标记saR191检测：由图4.1A可知50794和周豆13经SSR标记saR1片段加、翱照品种L83・2352相同，说明50794、周豆13与对照品种L83・2肴廁向晶标记。标记sat_064检测：由图4・IB可知科8923—4、合豆1号、周豆13、铁950f彳霜郑區0007等6个品种经过SSR标记sat064检测，片段大小与对照品利183・2352相同，说明科8923-4.合豆1号、周豆13、铁95068・5、5S2負看相同的标记。 MWL12345678910A；Sa«l9l20.5）,表明F3家系对分嬴楼惰-S他姓車购因控制o3讨论本试验由于F2代分离群体在田问移植过程中大批单株死广，导致群体失衡，所以在利川F2代抗性鉴定筛选出的一个朵合单株建立F3代家系作为抗性遗传分析的材料。抗性遗传分析表明该家系对分离物PSMC1的抗性由一个显性单基因控制。然而，该结果不能说明亲本豫豆29抗大豆疫霉菌的抗性只受一个显性单基因控制，因为F3代家系只是由F2代分离群体的一个单株衍生的，在口交过程屮可能造成基因的丢失，一个F3代群体验证结果不能代表亲本的全部抗病基因组成。对豫豆29抗病基因推导及分子检测结果表明该品种可能含有两个抗病基因RPs1c+Rps8、Rps1k+Rps8的组合。豫豆29不但农艺综合性状优良，而且利于选育，该甜种是一个很好的抗病育种材料，对于该品种分子标记的筛选及抗病基因的定位、作图工作有待于进一步进行，以期在人豆抗病育种方面培育出性状优良且抗病较好的品种并用于生产。 结论1大豆资源抗疫霉根腐病抗病基因分析来口山东、山西、黑龙江、吉林、辽宁、安徽、北京，河北、河南、浙江、江苏及湖北等12个省市的品种（系）屮，其屮抗PSBX菌株的品种（系）最多，为78个，占鉴定品种总数的64.5%,抗PSXJ-2菌株的品稀（系）最少，为44个，庶数的36.4%。黄淮海地区抗性表现较好。121份大豆詁种（系）屮，抗6・12个菌株的大豆品种有60个，占大豆品种总数的49.6%,其屮抗12个菌株的品种冇9个，抗“个菌株的品种有5个，抗10个菌株的有8个品种，抗9个菌株的有15个品种，抗8个菌株的有17个品种，抗7个菌株的有13个品种，抗6个菌株的有2个品种，抗1.5个I荣I株的大豆品种有27个，占大豆品种总数的22.3%o对12个I荣I株都不表现抗病的品种有25个，占总数的20.7%。通过与14个鉴别詁种（系）对12个鉴别菌株反应型的比较，共产生49个不同的抗病反应型，抗病资源丰富度为40.5%。反应型RRSRSRRRRRSS出现的频率占抗病反应型总数的11・5%；反应型RRRRRRRRRRRR出现的频率次之，占稱反应型总数的9.4%；有34个品种的反应型仅出现〜次。品种长农14号的反应型与含抗病基因RPs1a的品种Har1on的反应型一致；吉黄462号、99鉴15、商93118?nf79.中野2号具有相同的反应型，与含抗病基HRps3c的品种PRX山皮应型生軌东师94-1,5,科8924・3、野9和50794等4个品种（系）的Ps4的品系L85.2352的反应型相同，可能含有RPs4：滑豆20和X34反应型与含抗病基因RPs5的品种L85-3059的反应型一致。有83个品种的反应型与含已知抗病基因的14个詁种的反应型不同。其屮32个甜种（系）产生12个两个抗病基因组合的反应型：科新4号、周豆12、周9521・3—4・10、周豆13、铁95068.5、郑9525、豫豆29、郑971Ps1c+Rps8、Rps1k+Rps8、Rps1a+Rps4曾唇牢歎W?和科新3号等4个品种的反应型与抗病基因组合Rps3a+Rpss因Sp¥K睡2S轅十反口5P妙b组1•与CX-fefp?S1^.-A口应SP一痢组K曉卤啟4、Rps3c+Rps4、Rps4+Rps5反应型一致；晋大53、Ic+Rps4、Rpslk+Rps4的反应型一致；绥02—.3b的反应型一致；濮8004的反应型与抗病基因Rps致;b晦展廊中黄17、中作983、合丰41号、绥农10号、绥02—41b+R5、绥0Ps6,Rpslk+Rps6的反应型一致；品种51的反应型与绥98-6227.7、绥02・259、绥99.3219和绥01—525丄致丁吊黄F6和冀黄104具有相同的反应型与抗病基因Rps7大豆抗疫蛊根腐病抗痫基因分析及分了•咎定 的反应型一致。另有51个品种共产生37个新的反应型，它们既不同于14个鉴别寄主的反应型，也不同于两个含有已知抗病基因品种（系）组合的反应型，占反应型总数的74%,丰富度达72.5%。2抗病基因的分子鉴定根据基因推导分析和SSR标记saa159和saR009对28个品种（系）的检测，果，螢议长农14号的含有Rps1a,用早3号，长农8号、中黄17、中作983、合丰41号、绥农10号，绥02—45、绥02.33、绥99—3219、绥01.5251、需Bg・sfa-?-5ps倉基因组合，品系50052含有Rps1c+Rps3»藁够鼬推导分析和SSR标记satt191和sat064对科8924・35、合豆1号、周豆13、铁95068.5、50794、03016、郑97196、皖豆15等8份大豆豆13含有基因Rps1a+Rps4的组合，品系50794含有抗病基因Rps4o3Wi11iams和豫豆29朵交组合F3代家系抗性遗传分析利用Wi1iiams与豫豆29杂交F1代自交产生F2代，从中选择一个杂合单株F——§5自交产生F3代家系进行抗病遗传分析。采用子叶和下胚轴两种接种法相结合进行抗性鉴定，对该家系203个单株进行抗性鉴定。结果表明有153个为抗病反应型，有50个单株的反应型为感病，经卡平方检测抗病株和感病株比例符合3：1；表明该家系对分离物PSMC1的抗性由一个显性单基因控制。 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